Polinucleótido que codifica una proteína híbrida de la subunidad pequeña de la ADP glucosa pirofosforilasa (AGP) que,

cuando la proteína híbrida se expresa con una subunidad grande de AGP para formar una enzima AGP mutante, proporciona un enzima AGP mutante que es menos sensible la inhibidor alostérico de fosfato inorgánico (Pi) que el enzima AGP natural, y comprendiendo la proteína híbrida una secuencia aminoterminal que comprende los primeros 150 a 250 aminoácidos del extremo aminoterminal de endosperma de maíz AGP proteína de la subunidad pequeña y una secuencia carboxiterminal que comprende los 276 residuos terminales o entre 295 y 300 residuos terminales del extremo carboxiterminal de una proteína de la subunidad pequeña de la AGP de tubérculo de patata

Variantes de la ADP-glucosa pirofosforilasa que afectan a la sensibilidad al fosfato y otros parámetros.

Antecedentes de la invención

El enzima ADP glucosa pirofosforilasa (AGP) cataliza la conversión del ATP y el a-glucosa-1-fosfato en ADP-glucosa y pirofosfato. Se utiliza la ADP-glucosa como donador de glucosilos en la biosíntesis del almidón en vegetales y en biosíntesis del glucógeno en bacterias. La importancia de la ADP-glucosa pirofosforilasa como enzima clave en la regulación de biosíntesis del almidón se indicó en el estudio del endosperma de mutantes de maíz (Zea mays) deficientes en almidón (Tsai et al., 1966; Dickinson et al., 1969).

Las pruebas bioquímicas y genéticas han identificado la AGP como el enzima clave en la biosíntesis del almidón en las plantas superiores y la biosíntesis del glucógeno en E. coli (Preiss et al., 1994; Preiss et al., 1996). La AGP cataliza lo que se considera como la etapa inicial de la vía biosintética del almidón siendo el producto de la reacción el donador de glucosilo activado, la ADP-glucosa. Ello lo utiliza la almidón sintasa para la extensión del polímero de polisacárido (estudiado en Hannah, 1996).

Los estudios iniciales con AGP de patata demostraron que la expresión en E. coli proporcionó un enzima con unas propiedades alostéricas y cinéticas muy similares a las del enzima del tubérculo natural (Iglesias et al., 1993; Ballicora et al., 1995). Greene et al. (1996a; 1996b) demostraron la utilidad del sistema de expresión bacteriana en sus estudios sobre la estructura y función con la AGP de patata. Se identificó una pluralidad de mutaciones importantes al cartografiar zonas de fijación alostéricas y del sustrato (Okita et al., 1996).

Se han aislado enzimas AGP a partir de bacterias y vegetales. La AGP bacteriana consiste en un homotetrámero, mientras que las AGP vegetales de tejidos fotosintéticos y no fotosintéticos es un heterotetrámero compuesto por dos subunidades distintas. El enzima vegetal está codificado por dos genes distintos, siendo una subunidad mayor que la otra. Esta característica se ha observado en un cierto número de vegetales. Las subunidades de AGP de las hojas de espinacas presentan unos pesos moleculares de 54 kDa y 51 kDa, estimados mediante SDS-PAGE. Ambas subunidades son inmunorreactivas ante los anticuerpos contra la AGP purificada a partir de hojas de espinacas (Copeland et al., 1981; Morell et al., 1988). Los análisis inmunológicos que utilizan antisuero preparado contra las subunidades pequeña y grande de las hojas de espinacas demostraron que la AGP de tubérculo de patata está codificado asimismo por dos genes (Okita et al., 1990). Se han aislado asimismo clones de ADNc de las subunidades de tubérculo de patata (50 y 51 kDa) y se han secuenciado (Muller-Rober et al., 1990; Nakata et al., 1991). La subunidad grande de AGP de tubérculo de patata es termoestable (Nakata et al., supra).

Tal como propusieron Hannah y Nelson (Hannah et al., 1975; Hannah et al., 1976), tanto el Shrunken-2 (Sh2) (Bhave et al., 1990) como el Brittle-2 (Bt2) (Bae et al., 1990) son genes estructurales de la ADP-glucosa pirofosforilasa de endosperma de maíz. Sh2 y Bt2 codifican la subunidad grande y la subunidad pequeña del enzima, respectivamente. A partir de la secuenciación del ADNc, las proteínas Sh2 y Bt2 presentaron un peso molecular previsto de 57,179 Da (Shaw et al., 1992) y 52,224 Da, respectivamente. El endosperma es la zona de máxima precipitación de almidón durante el desarrollo de los granos de maíz. Los mutantes del endosperma de maíz Sh2 y bt2 presentan unos niveles de almidón muy reducidos, lo que corresponde a unos niveles deficientes de actividad de la AGP. Se ha demostrado que las mutaciones de cada gen reducen la actividad de la AGP en aproximadamente el 95% (Tsai et al., supra; Dickinson et al., supra). Además, se ha observado que la actividad enzimática aumenta con la dosis de los alelos Sh2 y Bt2 naturales funcionales, mientras que los enzimas mutantes presentan unas propiedades cinéticas alteradas. La AGP constituye la etapa que limita la velocidad de la biosíntesis del almidón en los vegetales. Stark et al. (1992) dispusieron una forma mutante de AGP de E. coli en el tubérculo de patata y obtuvieron un aumento del 35% en el contenido de almidón.

Se ha descrito la clonación y caracterización de los genes que codifican las subunidades del enzima AGP en diversos vegetales. Estos comprenden el ADNc de Sh2 (Bhave et al., supra), ADN genómico de Sh2 (Shaw et al., supra), y el ADNc de Bt2 (Bae et al., supra) de maíz; el ADNc (Anderson et al., 1989) y el ADN genómico (Anderson et al., 1991) de la subunidad pequeña de arroz; y los ADNc de las subunidades pequeña y grande de hojas de espinaca (Morell et al., supra) y de tubérculo de patata (Muller-Rober et al., supra; Nakata et al., supra). Además, se han aislado los clones de ADNc a partir del endosperma y tejidos de hojas del trigo (Olive et al., 1989) y hojas de Arabidopsis thaliana (Lin et al., 1988). Las secuencias de aminoácidos de una subunidad pequeña de AGP de maíz y tubérculo de patata, y las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican los mismos, se han depositado en Genbank con los números de registro AF334959 y X61186, respectivamente.

La AGP funciona como enzima alostérico en todos los tejidos y organismos investigados hasta la fecha. En primer lugar se demostró que las propiedades alostéricas de la AGP eran importantes en E. coli. Se aisló un mutante de E. coli que hiperproducía glucógeno y se cartografió la mutación del gen estructural para la AGP, designándose como glyC. Se demostró que la E. coli mutante, conocida como glyC-16, era más sensible al activador, la fructosa 1,6 bifosfato, y menos sensible al inhibidor, el AMPc (Preiss, 1984). Aunque las AGP vegetales son asimismo alostéricas, responden a distintas moléculas efectoras que la AGP bacteriana. En los vegetales, el ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA) actúa como activador mientras que el fosfato (PO₄) actúa como inhibidor (Dickinson et al., supra).

Breve sumario de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de subunidades híbridas de la AGP tal como se definen en la reivindicación 4 y a los polinucleótidos tal como se definen en las reivindicaciones 1 a 3 que codifican las proteínas híbridas. La presente invención proporciona enzimas AGP mutantes tal como se definen en las reivindicaciones 33 y 34 que comprenden una subunidad híbrida de la presente invención que son menos sensibles al fosfato inorgánico que los enzimas AGP naturales.

La presente invención se refiere asimismo a vegetales tal como se definen en las reivindicaciones 5 a 13 que comprenden un polinucleótido que codifican una proteína de la subunidad híbrida de la AGP de la presente invención.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento tal como se define en las reivindicaciones 14 a 17 para producir un vegetal que comprende un polinucleótido de la presente invención. Los vegetales producidos según la presente invención comprenden enzimas AGP que son menos sensibles al fosfato inorgánico que el enzima AGP natural.

La presente invención se refiere asimismo a constructos de expresión tal como se definen en las reivindicaciones 18 a 32 que comprenden un polinucleótido de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A representa la secuencia de nucleótidos de una subunidad pequeña híbrida de maíz/patata (MPss) de la presente invención. Los residuos 1 a 597 proceden de la subunidad pequeña del endosperma de maíz y los residuos 598 a 1428 (representados en negrita) proceden de la subunidad pequeña del tubérculo de patata. La figura 1B representa la secuencia de aminoácidos de una subunidad pequeña híbrida de maíz/patata (MPss) codificada por la secuencia representada en la figura 1A. La secuencia de residuos de aminoácidos 1 a 199 procede de la subunidad pequeña de endosperma de maíz. La secuencia de residuos de aminoácidos 200 a 475 (representada en negrita) procede de la subunidad pequeña de tubérculo de patata.

La figura 2A representa la MPss híbrida descrita en la figura 1B en la que los números...

1. Polinucleótido que codifica una proteína híbrida de la subunidad pequeña de la ADP glucosa pirofosforilasa (AGP) que, cuando la proteína híbrida se expresa con una subunidad grande de AGP para formar una enzima AGP mutante, proporciona un enzima AGP mutante que es menos sensible la inhibidor alostérico de fosfato inorgánico (Pi) que el enzima AGP natural, y comprendiendo la proteína híbrida una secuencia aminoterminal que comprende los primeros 150 a 250 aminoácidos del extremo aminoterminal de endosperma de maíz AGP proteína de la subunidad pequeña y una secuencia carboxiterminal que comprende los 276 residuos terminales o entre 295 y 300 residuos terminales del extremo carboxiterminal de una proteína de la subunidad pequeña de la AGP de tubérculo de patata.

2. Polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido codifica una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos representada en la SEC. ID. N.º 1 o en la SEC. ID. N.º 3.

3. Polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos representada en la SEC. ID. N.º 2.

4. Proteína híbrida de la subunidad pequeña de la ADP glucosa pirofosforilasa (AGP) codificada por el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Vegetal transgénico que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Vegetal según la reivindicación 5, en el que el vegetal expresa asimismo la subunidad grande de la AGP del maíz.

7. Vegetal según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que el vegetal es un vegetal monocotiledóneo.

8. Vegetal según la reivindicación 7, en el que el vegetal monocotiledóneo se selecciona de entre el grupo que consiste en arroz, trigo, cebada, avena, sorgo, maíz, lirios y mijo.

9. Vegetal según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que el vegetal es un vegetal dicotiledóneo.

10. Vegetal según la reivindicación 9, en el que el vegetal dicotiledóneo se selecciona de entre el grupo que consiste en tabaco, soja, patata, boniato, rábano, col, colza, manzano y lechuga.

11. Vegetal según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el que la proteína de la subunidad pequeña de la AGP según la reivindicación 4 se expresa junto con la expresión de un polinucleótido que codifica una subunidad grande de la AGP, comprendiendo la subunidad grande una mutación que proporciona una mayor estabilidad térmica al vegetal, en el que la mutación se selecciona de entre el grupo que consiste en HS13, HS14, HS16, HS33, HS40, HS47, HS RTS 48-2 y HS RTS 60-1.

12. Vegetal según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en el que la proteína de la subunidad pequeña de la AGP según la reivindicación 4 se expresa junto con la expresión de un polinucleótido que codifica una subunidad grande de la AGP, comprendiendo la subunidad grande una mutación que proporciona mayor peso a las semillas del vegetal, comprendiendo la mutación:

13. Vegetal según la reivindicación 12, en el que la mutación en la subunidad grande comprende el par de aminoácidos serina:tirosina incorporado entre la tirosina de la posición 495 y la tirosina de la posición 496 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de la AGP natural de maíz.

14. Procedimiento para disminuir la sensibilidad al fosfato inorgánico de enzimas AGP en un vegetal, que comprende la introducción en el vegetal de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, que comprende las etapas de introducción del polinucleótido en una célula vegetal mediante bombardeo biolístico, electroporación, transformación en la que intervienen virus o transformación en la que interviene Agrobacterium, y diseminación de la célula vegetal para obtener el vegetal.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, que comprende además cultivar el vegetal con otro vegetal.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el vegetal es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13.

18. Constructo de expresión que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un elemento regulador para regular la expresión del polinucleótido.

19. Constructo de expresión según la reivindicación 18, en el que el elemento regulador se selecciona de entre el grupo que consiste en un promotor, una secuencia de finalización de la transcripción, un elemento potenciador y una secuencia de poliadenilación.

20. Constructo de expresión según la reivindicación 19, en el que promotor es funcional en una célula vegetal.

21. Constructo de expresión según la reivindicación 20, en el que promotor es un promotor específico de las semillas, un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de órganos, un promotor específico de frutos o un promotor de un virus vegetal.

22. Constructo de expresión según la reivindicación 21, en el que el promotor específico de las semillas es un promotor del gen de la ß-faseolina (de alubia roja) o un promotor del gen de la glicina (de soja).

23. Constructo de expresión según la reivindicación 21, en el que el promotor constitutivo promotor es un promotor CaMV, un promotor de la ubiquitina, un promotor de la actina o un promotor NOS.

24. Constructo de expresión según la reivindicación 21, en el que el promotor inducible se puede inducir mediante luz, calor, una hormona o un producto químico.

25. Constructo de expresión según la reivindicación 21, en el que el promotor específico de órganos es un promotor E8 de tomate.

26. Constructo de expresión según la reivindicación 21, en el que el promotor de virus vegetales es un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) o un promotor 19S del CaMV.

27. Constructo de expresión según la reivindicación 20, en el que el promotor es un promotor de la proliferación, un promotor Ap3 o un promotor del choque térmico.

28. Constructo de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 27, en el que el constructo de expresión comprende un gen marcador seleccionable dominante para seleccionar células vegetales que se hayan transformado con el constructo de expresión.

29. Constructo de expresión según la reivindicación 28, en el que el gen marcador se selecciona de entre el grupo que consiste en un gen que codifica la resistencia a los antibióticos y un gen que codifica la resistencia a los herbicidas.

30. Constructo de expresión según la reivindicación 29, en el que el gen de la resistencia a los antibióticos se selecciona de entre el grupo que consiste en higromicina, kanamicina, bleomicina, G418, estreptomicina, paromomicina y espectinomicina.

31. Constructo de expresión según la reivindicación 29, en el que el gen de la resistencia a los herbicidas es un gen que proporciona resistencia a la fosfinotricina acetiltransferasa o glifosato.

32. Constructo de expresión según la reivindicación 28, en el que el gen se selecciona de entre el grupo que consiste en genes que codifican la ß-glucuronidasa, la luciferasa y la proteína verde fluorescente.

33. Enzima mutante de la ADP glucosa pirofosforilasa (AGP) que comprende la proteína según la reivindicación 4.

34. Enzima mutante según la reivindicación 33, que comprende una proteína de la subunidad pequeña y una subunidad grande según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.