Un metodo para modificar la morfologia en una planta, que comprende introducir en una planta al menos un gen quimerico que comprende una secuencia promotora asociada operativamente con una secuencia de acido nucleico,

siendo la secuencia promotora operativa para dirigir la expresi6n en celulas especificas de la planta, y la secuencia de acidos nucleicos que codifica al menos un producto genico capaz de alterar el metabolismo de las celulas especificas y/o pr6ximas, o de causar la muerte de las mismas, en donde la secuencia promotora es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, y en donde la secuencia promotora comprende la secuencia que se muestra en SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con la secuencia mostrada en la SEC ID NO 1 o la SEC ID NO 7, que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre la totalidad de la longitud de las secuencias a comparar, y en donde expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva

Modificaci6n del desarrollo y morfologia de una planta CAMPO DE LA INVENCION.

La invenci6n se refiere a un metodo para modificar el desarrollo y la morfologia de una planta. La invenci6n se refiere ademas al uso de una secuencia de DNA para regular la expresi6n genica ex6gena en los tejidos de una planta. La invenci6n tambien se refiere a una secuencia de DNA identificada que actua como promotor que es operativo para la expresi6n directa en celulas especificas de una planta.

FUNDAMENTO.

El control de la morfologia de las plantas es de una gran importancia en la producci6n comercial de plantas para fines agricolas u horticolas, para potenciar la productividad y el rendimiento, para mejorar la eficacia de los cultivos y las cosechas, y para conseguir la estetica que se desea. Los aspectos que requieren un control o modificaci6n pueden incluir la morfologia de las flores, frutos o tuberculos, la cantidad de flores, frutos, semillas o tuberculos, la extensi6n de las raices primarias y laterales, la forma de los brotes aereos o el tronco, y la presencia de espinas o pelos urticantes. Otros aspectos que es de desear que puedan ser controlados incluyen el adelanto o el retraso de la abscisi6n de las hojas, flores o fruto, la liberaci6n de las semillas, y la producci6n de 6rganos de almacenamiento o glandulas secretoras.

Los cambios morfol6gicos ocurren con frecuencia como resultado del impacto ambiental sobre la planta, incluyendo los dafos fisicos, la predaci6n por los herbivoros, las infecciones pat6genas, el frio, el calor y la sequia. Frecuentemente pueden ser provocados deliberadamente por la intervenci6n humana, bien sea fisicamente (poda, flexi6n, atado, apilamiento o corte de 6rganos o estructuras particulares) o bien quimicamente (aplicaci6n de productos agroquimicos y sustancias para el crecimiento de las plantas) . Sea cual sea el agente causante, los cambios morfol6gicos vienen decretados por la expresi6n de genes dentro de las celulas de la propia planta. El aparecer el cambio, la iniciaci6n de la expresi6n de uno o mas genes ocurre en aquellos tejidos particulares en los que se requiere que el crecimiento de la celula, la proliferaci6n, el desarrollo o la necrosis culminen en el cambio fisico en bruto.

La expresi6n de un gen depende de que su secuencia de DNA se transcriba en RNA por acci6n de la RNA polimerasa. Para lograr esto, la RNA polimerasa tiene que reconocer y unirse a una regi6n de la secuencia de DNA situada secuencia arriba (es decir, 5') de la secuencia que codifica el gen, con el fin de que se inicie la transcripci6n. Tal regi6n se denomina promotor del gen. La naturaleza intrinseca de la secuencia del promotor determina las circunstancias y la manera en la que se expresa el gen.

Expresandolo de una forma amplia, hay cuatro tipos de promotores que se encuentran en los tejidos vegetales: constitutivos, especificos del tejido, regulados por el desarrollo e induciblesrepresibles, si bien se ha de entender que necesariamente estos tipos no son mutuamente excluyentes.

Un promotor constitutivo dirige la expresi6n de un gen a traves de las diversas partes de una planta, continuamente durante el desarrollo de esa planta, aun cuando el gen no puede expresarse al mismo nivel en todos los tipos de celulas. Los ejemplos de promotores constitutivos conocidos incluyen los asociados con el transcripto 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell et al, 1985) , el gen de la actina 1 del arroz (Zhang et al, 1991) y el gen de la ubiquitina 1 del maiz (Cornejo et al, 1993) .

Un promotor especifico del tejido es uno que dirige la expresi6n de un gen en una parte de la planta (o en unas pocas partes) , normalmente a lo largo del tiempo de vida de esas partes de la planta. La categoria de promotor especifico del tejido incluye tambien comunmente promotores cuya especificidad no es absoluta, es decir, tambien pueden dirigir la expresi6n a un nivel mas bajo en tejidos distintos de los del tejido preferido. Los ejemplos de promotores especificos del tejido conocidos en la tecnica incluyen aquellos que estan asociados con el gen de la patatina expresado en el tuberculo de la patata, y el gen de la glutenina de alto peso molecular expresado en el endospermo del trigo, la cebada o el maiz.

Un promotor regulado por el desarrollo dirige un cambio en la expresi6n de un gen en una o mas partes de una planta en un momento especifico durante el desarrollo de la planta. El gen puede expresarse en esa parte de la planta en otros momentos a un nivel diferente (normalmente mas bajo) , y puede tambien expresarse en otras partes de la planta.

Un promotor inducible es capaz de dirigir la expresi6n de un gen en respuesta a un inductor. En ausencia del inductor el gen no se expresara. El inductor puede actuar directamente sobre la secuencia del promotor, o puede actuar contrarrestando el efecto de una molecula de represor. El inductor puede ser un agente quimico tal como un metabolito, una proteina, un regulador del crecimiento, o un elemento t6xico, una tensi6n fisiol6gica tal como calor, lace

raci6n, o presi6n osm6tica, o una consecuencia indirecta de la acci6n de un pat6geno o una plaga. Un promotor regulado por el desarrollo podria describirse como un tipo especifico de promotor inducible que responde a un inductor end6geno producido por la planta o a un estimulo ambiental en un punto concreto del ciclo de vida de la planta. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen los asociados con la respuesta a la laceraci6n, tal como se describe en Warner et al (1993) , respuesta a la temperatura como se describe en Benfey y Chua (1989) , e inducido quimicamente, como se describe en Gatz (1995) .

Una secuencia promotora puede comprender cierto numero de dominios definidos necesarios para su funci6n. El primero de estos comprende aproximadamente 70 pares de bases situadas inmediatamente secuencia arriba (esto es, 5') del gen estructural y forma el promotor nucleo o core. El promotor nucleo contiene las cajas o secuencias CAAT y TATA y define el sitio de la iniciaci6n de la transcripci6n para el gen. Una serie de secuencias reguladoras secuencia arriba del promotor nucleo constituyen el resto de la secuencia del promotor y determinan los niveles de expresi6n, los patrones espacial y temporal de la expresi6n, y la respuesta a los inductores. Ademas, algunos promotores contienen elementos de secuencia que actuan potenciando el nivel de expresi6n, por ejemplo el del promotor de la plastomicina del guisante, como se describe en la publicaci6n de patente internacional nO WO 97/20056.

La modificaci6n genetica de las plantas depende de la introducci6n de genes quimericos en las celulas vegetales y de su expresi6n controlada bajo la direcci6n de un promotor. Pueden obtenerse promotores de diferentes fuentes, entre las que se incluyen animales, plantas, hongos, bacterias y virus, y los distintos promotores pueden trabajar con eficacias distintas en tejidos distintos. Los promotores pueden tambien se construidos sinteticamente.

Con frecuencia puede ser deseable expresar genes introducidos en cierto numero de tejidos diferentes en una planta. Por ejemplo, la expresi6n de una resistencia contra un agente pat6geno o una plaga, o la tolerancia a temperaturas extremas, puede expresarse de la mejor forma por todos los tejidos en una planta. Del mismo modo, podria ser deseable asegurar la expresi6n de los transgenes en todo instante a lo largo del desarrollo de la planta. Tambien, un promotor que se expresa de una manera que es inmune a la influencia de inductores o represores resultantes de estimulos ambientales imprevistos, puede ser tambien util para asegurar la expresi6n continuada de un rasgo. Con estos fines, seria de desear el uso de un promotor "constitutivo". Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor 35S del CaMV. Para cereales, el promotor de ubiquitina es un promotor constitutivo a elegir (Christensen y Quail, 1996) .

Sin embargo, en algunos casos es mas deseable controlar la localizaci6n de la expresi6n del gen en una planta transgenica. Esto puede potenciar el efecto de la expresi6n genica asegurando que la expresi6n ocurre preferentemente en aquellos tejidos en los que es mas eficaz el efecto del producto genico. Por el mismo argumento, la expresi6n modulada puede reducir la perdida potencial de rendimiento limitando el drenaje de recursos en la planta. Otras ventajas incluyen la limitaci6n de la expresi6n genes agron6micamente utiles pero generalmente nocivos para tejidos especificos por la localizaci6n y la compartimentaci6n de la expresi6n genica en casos en los que el producto genico... [Seguir leyendo]

1a. Un metodo para modificar la morfologia en una planta, que comprende introducir en una planta al menos un gen quimerico que comprende una secuencia promotora asociada operativamente con una secuencia de acido nucleico, siendo la secuencia promotora operativa para dirigir la expresi6n en celulas especificas de la planta, y la secuencia de acidos nucleicos que codifica al menos un producto genico capaz de alterar el metabolismo de las celulas especificas y/o pr6ximas, o de causar la muerte de las mismas, en donde la secuencia promotora es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, y en donde la secuencia promotora comprende la secuencia que se muestra en SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con la secuencia mostrada en la SEC ID NO 1 o la SEC ID NO 7, que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre la totalidad de la longitud de las secuencias a comparar, y en donde expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

2a. Un metodo segun la reivindicaci6n 1a, en el que el producto genico de la secuencia de acidos nucleicos es una molecula citot6xica.

3a. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el producto genico de la secuencia de acidos nucleicos es una proteina desactivadora del ribosoma (RIP) o una variante o una parte funcional de la misma.

4a. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1a o 2a, en el que el producto genico de la secuencia de acidos nucleicos es una proteina antiviral de la hierba carmesi o una variante o una parte funcional de la misma.

5a. Un metodo segun la reivindicaci6n 4a, en el que la proteina antiviral de la hierba carmesi (PAP) es proteina antiviral de la hierba carmesi S (PAPS) o una variante o parte funcional de la misma.

6a. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se modifica la excrecencia de una yema lateral y/o un brote lateral.

7a. Un metodo segun la reivindicaci6n 6a, en el que la excrecencia de una yema lateral y/o un brote lateral se reduce, se evita o se retrasa.

8a. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2a a 7a, en el que la excrecencia de una yema lateral y/o un brote lateral se modifica interfiriendo el metabolismo o causando la muerte de celulas implicadas en el desarrollo de la yema lateral.

9a. Un acido nucleico que comprende una secuencia promotora, siendo dicha secuencia promotora la secuencia que se muestra como SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, o una parte de las mismas que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, y que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre la longitud completa de las secuencias a comparar.

10a. Un acido nucleico segun la reivindicaci6n 9a, en el que dicha secuencia tiene al menos un 70%, preferentemente al menos un 85%, mas preferentemente al menos un 90%, mas preferentemente al menos un 97% de identidad con SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7.

11a. Un acido nucleico segun la reivindicaci6n 9a o la reivindicaci6n 10a, en el que el acido nucleico comprende ademas una secuencia de acido nucleico que codifica una molecula citot6xica.

12a. Un acido nucleico segun la reivindicaci6n 11a, en el que la secuencia de acido nucleico codifica una proteina desactivadora del ribosoma (RIP) o una variante citot6xica o parte funcional citot6xica de la misma.

13a. Un acido nucleico segun la reivindicaci6n 11a, en el que la secuencia de acido nucleico codifica una proteina antiviral de la hierba carmesi o una variante citot6xica o parte funcional citot6xica de la misma.

14a. Un acido nucleico segun la reivindicaci6n 13a, en el que la proteina antiviral de la hierba carmesi (PAP) es proteina S antiviral de la hierba carmesi o una variante citot6xica o parte funcional de la misma.

15a. Un gen quimerico que comprende una secuencia promotora asociada operativamente con una secuencia de acido nucleico, comprendiendo la secuencia promotora la secuencia que se muestra en SEC ID NO 1, SEC ID NO 7, o parte de las mismas que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, y que es capaz de regular la expresi6n de un gen en una yema lateral y/o un brote lateral, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre la longitud completa de las secuencias a comparar.

16a. Un gen quimerico segun la reivindicaci6n 15a, en el que la secuencia tiene al menos un 70%, preferentemente al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, preferentemente al menos un 97% de identidad con SEC ID NO 1

o SEC ID NO 7.

17a. Un gen quimerico segun la reivindicaci6n 15a o la reivindicaci6n 16a, en el que el acido nucleico comprende ademas una secuencia de acidos nucleicos que codifica una molecula citot6xica.

18a. Un gen quimerico segun la reivindicaci6n 17a, en el que la secuencia de acidos nucleicos codifica una proteina desactivadora del ribosoma (RIP) o una variante citot6xica o parte funcional citot6xica de la misma.

19a. Un gen quimerico segun la reivindicaci6n 17a, en el que la secuencia de acidos nucleicos codifica una proteina antiviral de la hierba carmesi o una variante citot6xica o parte funcional citot6xica de la misma.

20a. Un gen quimerico segun la reivindicaci6n 19a, en el que la proteina antiviral de la hierba carmesi (PAP) es proteina antiviral de la hierba carmesi S (PAPS) o una variante citot6xica o parte funcional citot6xica de la misma.

21a. Un DNA recombinante que comprende DNA vector y un acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 9a a 14a, o un gen quimerico segun una cualquiera de las reivindicaciones 15a a 20a.

22a. Una planta producida segun el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1a a 8a.

23a. Una planta que comprende el acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 11a a 14a, o un gen quimerico segun una cualquiera de las reivindicaciones 17a a 20a.

24a. Una planta segun las reivindicaciones 22a o 23a, en donde la planta es de la familia de las solanaceas.

25a. Una planta segun la reivindicaci6n 24a, en donde la planta es de la subfamilia de las cestroideas.

26a. Una planta segun la reivindicaci6n 25a, en donde dicha planta es del genero Nicotiana.

27a. Una planta segun la reivindicaci6n 25a, en donde dicha planta es Nicotiana tabacum.

28a. Una planta segun la reivindicaci6n 22a o la reivindicaci6n 23a, en donde dicha planta se elige entre el grupo consistente en tomate, pepino, Petunia, Dianthus, Picea, Eucaliptus, Pinus, Euacalyptus, Populus, patata, tabaco, algod6n, lechuga, berenjena, mel6n, calabaza, guisante, canola, soja, remolacha azucarera, girasol, trigo, cebada, centeno, arroz y maiz.

29a. Una celula vegetal que comprende el acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 11a a 14a, o un gen quimerico segun una cualquiera de las reivindicaciones 17a a 20a, o un DNA recombinante segun la reivindicaci6n 21a.

30a. Un metodo para regular la expresi6n de un gen en una planta, comprendiendo el metodo introducir en una planta un acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 9a a 14a asociado operativamente con una secuencia de codificaci6n de un gen cuya expresi6n se ha de regular.

31a. Un metodo para modificar el metabolismo dentro de una celula de una planta transgenica, comprendiendo el metodo introducir en una planta un acido nucleico segun una cualquiera de las reivindicaciones 9a a 14a o un gen quimerico segun una cualquiera de las reivindicaciones 15a a 20a.

32a. El uso de un acido nucleico que comprende una secuencia promotora que tiene una secuencia como se muestra en SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, o una parte funcional de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de identidad con la secuencia mostrada en la SEC ID NO 1 o la SEC ID NO 7, que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, para modificar la morfologia de una planta, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre la totalidad de la longitud de las secuencias a comparar, y en donde expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

33a. El uso de un gen quimerico segun una cualquiera de las reivindicaciones 15a a 20a, o de un acido nucleico se5 gun una cualquiera de las reivindicaciones 9a a 14a, para transformar una planta para modificar la morfologia de la planta.

34a. El uso de un acido nucleico que comprende una secuencia promotora que tiene una secuencia como se muestra en SEC ID NO 1 o SEC ID NO 7, o una parte de la misma que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, o una secuencia que tiene al menos un 65% de 10 identidad con la secuencia mostrada en la SEC ID NO 1 o la SEC ID NO 7, que es operativa para dirigir la expresi6n de manera sustancialmente especifica en una yema lateral y/o un brote lateral, para alterar el metabolismo en una planta, en donde el porcentaje de identidad se determina sobre la totalidad de la longitud de las secuencias a comparar, y en donde expresi6n sustancialmente especifica significa que el promotor dirige la expresi6n de la secuencia de acidos nucleicos asociada con dicho promotor predominantemente en yemas laterales y/o brotes laterales, de forma tal que menos del 50% del nivel de expresi6n global de dicha secuencia de acidos nucleicos ocurre en cualquier otro tejido o celula de la planta respectiva.

35a. Un gen quimerico que se puede obtener a partir del clon pBNP 0850501001 (NCIMB 41343) .

Figura 3

Figura 5

Figura 6

Figura 7