Uso de inhibidores de eNOS en regeneración nerviosa.

La presente invención se refiere al empleo de inhibidores de la actividad y/o expresión de la isoforma endotelial de la enzima NO sintasa (eNOS) en la preparación de un medicamento para aumentar la velocidad de regeneración de nervios periféricos lesionados en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento.

Asimismo, contempla el empleo de vectores que dirigen la expresión de los inhibidores de eNOS en la fabricación de dichos medicamentos, lo que permite acelerar la recuperación de la comunicación neuromuscular tras la lesión mediante una sola aplicación por inyección intraneural

Uso de inhibidores de eNOS en regeneración nerviosa.

Campo de la invención

La presente invención tiene su campo de aplicación dentro del sector sanitario, principalmente aquel relacionado con lesiones nerviosas. En concreto está dirigida al empleo de inhibidores de la actividad y/o expresión de la isoforma endotelial de la enzima NO sintasa (eNOS) para acelerar la regeneración de nervios periféricos lesionados.

Antecedentes de la invención

El sistema nervioso se divide tradicionalmente en sistema nervioso central (SNC) y sistema nervioso periférico (SNP). El SNC está compuesto por el encéfalo, encerrado en el cráneo y su continuación inferior, la médula espinal, ubicada en el conducto raquídeo. La sustancia gris está formada fundamentalmente por los somas neuronales y células gliales, mientras que la sustancia blanca recibe su nombre por las fibras nerviosas mielínicas que la conforman. Los cuerpos neuronales, dentro de la sustancia blanca, están agrupados en núcleos y sus prolongaciones, organizadas histológicamente en fibras nerviosas, transcurren entre regiones del SNC formando fascículos o cordones nerviosos.

El SNP comprende todo el tejido nervioso existente fuera del encéfalo y médula espinal y está constituido por cuerpos neuronales organizados en ganglios, entrecruzamientos de fibras nerviosas o plexos y haces de fibras nerviosas de recorrido paralelo organizado en nervios. Los nervios periféricos son las vías de comunicación entre los centros cerebrales y medulares y el resto del cuerpo. Pueden ser sensitivos (aferentes), motores (eferentes) o mixtos.

Ante una lesión, las fibras nerviosas del sistema periférico nervioso mantienen la capacidad de regeneración, incluso de largas distancias, en mamíferos adultos. Esta es una de las características más reseñables que diferencian al sistema periférico nervioso del central.

Para que se lleve a cabo el re-crecimiento de las fibras nerviosas proximales hacia el extremo distal y la subsiguiente regeneración, debe producirse la degeneración Walleriana del extremo distal del nervio. Durante ese periodo tiene lugar la fragmentación y disolución de la mielina, la desdiferenciación de células de Schwann en células reactivadas con capacidad de formar cadenas celulares que expresan neurotropinas, neurotrofinas y moléculas de adhesión, y la activación de las neuronas dañadas (Ide C. (1996). Peripheral nerve regeneration. Neurosci Res 25(2):101-121). La composición molecular del microambiente local modificado en respuesta a la lesión determina la movilidad del cono de crecimiento y la orientación y el crecimiento axonal. La lesión del nervio también activa las células fagocíticas, como los macrófagos y las células de Schwann, que eliminan los restos de axones y mielina y producen citoquinas, las cuales potencian el crecimiento axonal y desencadenan la proliferación de células endoteliales, aumentando la angiogénesis (Ide C (1996); González-Hernández T. et al. (1999). Expression of three forms of nitric oxide synthase in peripheral nerve regeneration. J Neurosci Res 55(2):198-207).

Seddon (1943) clasifica las lesiones en nervios periféricos en tres grandes grupos: neuroapraxia, axonotmesis y neurotmesis.

Neuroapraxia: se define por un bloqueo de conducción local, con parálisis, en ausencia de degeneración Walleriana distal presentando una recuperación funcional completa (días o semanas). Macroscópicamente el nervio no presenta lesiones, histológicamente aparecen segmentos desmielinizados. Al no existir lesión axonal no existe regeneración y con ello tampoco existe signo de Tinel a nivel de la lesión.

Axonotmesis: se define por una discontinuidad axonal y una degeneración Walleriana distal y una regeneración axonal proximal. Tanto el peri como el endoneuro permanecen intactos. La recuperación nerviosa es de 1,5 mm por día.

Neurotmesis: es la lesión nerviosa más severa, equivalente a una disrupción fisiológica del nervio completa, pudiendo o no existir una sección nerviosa en el momento.

Tras la lesión, la función nerviosa degenera de forma secuencial: motora, sensibilidad propioceptiva, tacto, temperatura, dolor y componente simpático. La recuperación nerviosa se refleja en sentido inverso.

Sunderland (1951) amplió la clasificación sobre la base de que la axonotmesis presenta un pronóstico muy variado. Subdividió la axonotmesis de Seddon en tres grados, dependiendo del grado de lesión del componente conectivo del nervio.

Tipo I: equivalente a la neuroapraxia. La recuperación funcional es completa al cabo de semanas o meses.

Tipo II: el endoneuro y el perineuro se hallan intactos, pero los axones están fisiológicamente interrumpidos. Dado que el endoneuro está íntegro, la regeneración axonal está dirigida a lo largo de su recorrido original y por ello se puede esperar una recuperación funcional completa. El tiempo de recuperación depende del nivel de la lesión (generalmente meses), dado que los axones deben regenerarse distalmente hasta el órgano diana.

Tipo III: el endoneuro está interrumpido, quedando íntegro el perineuro. La recuperación funcional es incompleta por una serie de razones: la primera es una lesión retrógrada de los cuerpos celulares de mayor grado, que puede llegar a destruir la neurona o retrasar su recuperación. En segundo lugar aparece fibrosis interfascicular por presentar una lesión del endoneuro, lo que interfiere en la regeneración axonal. La tercera es el resultado de un mayor lapso de tiempo para inervar al órgano diana que ha podido sufrir cambios secundarios a la denervación que impidan una recuperación completa.

Tipo IV: la integridad del nervio se debe a un tejido cicatricial que contiene los fascículos nerviosos interrumpidos. La degeneración retrógrada y la fibrosis interfascicular son más acusadas, por lo que la recuperación es mínima. Presenta un signo de Tinel a nivel de la lesión que no progresa hacia distal, se espera un lapso de tres meses previa cirugía. Éste grado precisa la resección del segmento lesionado y la reparación quirúrgica o la reconstrucción nerviosa.

Tipo V: equivalente a la neurotmesis. Dado que se da en lesiones abiertas siempre está indicada una exploración quirúrgica. La recuperación funcional espontánea no existe.

La clasificación de Sunderland presenta una descripción anatómica de la lesión nerviosa, estando su utilidad clínica en debate. La mayoría de las lesiones no se pueden clasificar en un sólo grado dado que las lesiones mixtas son frecuentes a nivel de los nervios periféricos. Por ello Mackinnon describió un VI grado de lesión nerviosa que representa distintos grados de Sunderland en un mismo segmento nervioso lesionado. La subclasificación de la axonotmesis es improbable preoperatoriamente, siendo sólo realizable mediante un estudio histológico del nervio lesionado.

Se han sugerido en el estado de la técnica diferentes tipos de tratamientos para acelerar la regeneración de nervios periféricos, la mayoría de ellos invasivos y de aplicación crónica. Así, se han descrito tratamientos condicionantes y manipulaciones extrínsecas para acelerar la recuperación, como la administración de factores de crecimiento (Boyd JG, Gordon T. A dose dependent facilitation and inhibition of peripheral nerve regeneration by brain-derived neurotrophic factor. (2002) Eur J Neurosci 15 (4):613-626), estimulación eléctrica (Al-Majed et al. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration (2000) J Neurosci 20(7):2602-2608; Brushart et al. Electrical stimulation promotes motoneuron regeneration without increasing its speed or conditioning the neuron. (2002) J Neurosci 22(15):6631-6638), campos electromagnéticos (Sisken et al. Stimulation of rat sciatic nerve regeneration with pulsed eectromagnetic fields (1989) Brain Res 485(2):309-316; Greenebaum et al. Effects of pulsed magnetic fields on neurite outgrowth from chick embryo dorsal root ganglia (1996) Bioelectromagnetics 17(4):293-302; Longo et al. Electromagnetic fields influence NGF activity and levels following sciatic nerve transaction (1999) J Neurosci Res 55(2):230-237) y el tratamiento con oxígeno hiperbárico (Bajrovic et al. The effect of hyperbaric oxygen treatment on early regeneration of sensory axons after nerve crush in the rat (2002) J. Peripher Nerv Syst 7(3):141-148; Haapaniemi et al. Functional evaluation after rat sciatic nerve injury followed by hyperbaric oxygen treatment (2002) J Peripher Nerv Syst 7(3):149-154)....

1. Uso de un inhibidor de la actividad y/o expresión de eNOS seleccionado entre i) una molécula de ARN interferente dirigida contra el ARNm que codifica para la proteína eNOS y ii) una molécula de ADN, que codifica para una forma truncada mutante dominante negativo de la proteína eNOS, inserta en un sistema de expresión heterólogo, en la preparación de un medicamento para aumentar la velocidad de regeneración de nervios periféricos lesionados en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento.

2. Uso de un inhibidor, según la reivindicación 1, donde la molécula de ARN interferente (i) tiene la secuencia SEQ ID NO 3.

3. Uso de un inhibidor, según la reivindicación 1, donde la molécula de ADN (ii) se selecciona entre SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 5.

4. Uso de un inhibidor, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el medicamento se administra mediante inyección intraneural.

5. Uso de un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un inhibidor de la actividad y/o expresión de eNOS, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la preparación de un medicamento para aumentar la velocidad de regeneración de nervios periféricos lesionados en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento.

6. Uso de un vector, según la reivindicación 5, donde el vector es plasmídico y/o vírico.

7. Uso de un vector, según la reivindicación 6, donde el vector es lentiviral o adenoviral.

8. Uso de un vector, según la reivindicación 7, donde dicho vector es un vector recombinante adenoviral que comprende una molécula de ADN que codifica para una forma truncada mutante dominante negativa de la proteína eNOS.

9. Uso de un vector, según la reivindicación 8, donde el medicamento se administra mediante una única inyección intraneural.

10. Método para identificar agentes aceleradores de la regeneración en nervios periféricos que comprende: a) poner en contacto el agente a ensayar con eNOS y b) determinar si el agente a ensayar inhibe la actividad y/o expresión de eNOS.