Cultivo congelado o liofilizado, que comprende uno o más agente/s crioprotector/es seleccionado/s del grupo que consiste en uno o más compuesto/s implicado/s en la biosíntesis de ácidos nucleicos o uno o más derivado/s de cualquiera de tales compuestos;

y donde uno o varios agente/s crioprotector/es es/son seleccionado/s del grupo que consiste en bases de purina, bases de pirimidina, nucleósidos y nucleótidos; y donde el cultivo comprende de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 20% del agente crioprotector o una mezcla de agentes medidos como % p/p del material congelado; o en el caso de que el cultivo sea un cultivo liofilizado el agente crioprotector o mezcla de agentes está/n presente/s en una cantidad de 0.8% a 55% en peso; y donde el cultivo comprende uno o más organismos seleccionados del grupo que consisten en Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp.; Enterococcus spp., Pediococcus spp., Leuconostoc spp., o Oenococcus spp

Uso de compuestos implicados en biosíntesis de ácidos nucleicos como agentes crioprotectores.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente europea nº. EP 03077079.6, solicitada el 02 de Julio de 2003.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de cultivos microbianos congelados y liofilizados y compuestos implicados en la biosíntesis de ácidos nucleicos como agentes crioprotectores. Más particularmente la invención se refiere a cultivos obtenidos por el uso de tales agentes, que además de la actividad crioprotectora, confieren una actividad de cultivo metabólico aumentada cuando se inocula en el medio para ser fermentado o convertido. Tales cultivos congelados o liofilizados son útiles en la fabricación de numerosos productos alimenticios y de pienso.

Antecedentes de la invención

Microorganismos están implicados en la producción de alimentos y piensos incluyendo la mayoría de productos lácteos. Cultivos bacterianos, en particular cultivos de bacterias generalmente clasificadas como bacterias ácido-lácticas, son esenciales en la fabricación de todos los productos lácteos fermentados, queso y mantequilla. No obstante, cultivos de determinados microorganismos no bacterianos, por ejemplo determinadas levaduras y hongos, se utilizan para procesar alimentos y piensos. Cultivos de estos microorganismos son frecuentemente referidos como cultivos iniciadores e imparten características específicas para varios productos lácteos mediante la realización de varias funciones. Cultivos iniciadores son muy usados en una variedad de industrias tales como, la industria de los lácteos al igual que en la industria de fabricación de vino, y la industria de fabricación de zumo, la industria de procesamiento de la carne.

Cultivos de microorganismos también encuentran usos importantes en la bioconservación de productos alimenticios (Andersen et al., 1997).

Cultivos lácteos iniciadores comerciales se componen generalmente de lactosa y bacterias fermentadoras del ácido cítrico. Bacterias ácido-lácticas designan un grupo de bacterias gram positivas, no móviles microaerofílicas o anaeróbicas que fermentan azúcar con la producción de ácidos incluyendo ácido láctico. Industrialmente algunas de las bacterias ácido-lácticas más útiles incluyen especies de Lactococcus, especies de Streptococcus, especies de Enterococcus, especies de Lactobacillus, especies de Leuconostoc y especies de Pediococcus.

Cepas de cultivos iniciadores lácteos comúnmente usadas de bacterias ácido-lácticas son generalmente divididas en organismos mesofílicos que tienen temperaturas de crecimiento óptimo a aproximadamente 30ºC y organismos termofílicos que tienen temperaturas de crecimiento óptimo en la gama de aproximadamente 35ºC a aproximadamente 45ºC. Ejemplos de organismos del grupo mesofílico incluyen Lactococcus lactis subesp. lactis, Lactococcus lactis subesp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subesp. lactis biovar diacetylactis y Lactobacillus paracasei subesp. paracasei. Especies bacterianas de ácido láctico termofílico incluyen como ejemplos Strepococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subesp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subesp. bulgaricus y Lactobacillus acidophilus.

Cultivos lácteos iniciadores son también clasificados según su composición de especies específicas y uso industrial preferido. Un cultivo iniciador puro comprende sólo una única especie mientras que un cultivo mezclado comprende dos o más especies diferentes. Cultivos iniciadores son frecuentemente categorizados según la temperatura en la que se exponen al crecimiento óptimo o actividad enzimática máxima. Cultivos iniciadores mesofílicos típicamente tienen una temperatura óptima de aproximadamente 30ºC, mientras que cultivos termofílicos tienen una temperatura óptima de aproximadamente 35-45ºC (Nielsen y Ullum, 1999). Ejemplos de cultivos comerciales mesofílicos mezclados incluyen:

"O-cultivo" comprendiendo Lactococcus lactis subesp. lactis y Lactococcus lactis subesp. cremoris.

"D-cultivo" comprendiendo Lactococcus lactis subesp. lactis, Lactococcus lactis subesp. cremoris y Lactococcus lactis subesp. lactis biovar diacetylactis.

"L-cultivo" comprendiendo Lactococcus lactis subesp. lactis, Lactococcus lactis subesp. cremoris y especies Leuconostoc.

"LD-cultivo" comprendiendo Lactococcus lactis subesp. lactis, Lactococcus lactis subesp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetilactis y especies Leuconostoc.

Un O-cultivo se utiliza para hacer queso sin agujeros (Cheddar, Cheshire, Feta). Un D-cultivo se utiliza para hacer mantequilla. Un L-cultivo se utiliza para hacer queso con agujeros pequeños (p. ej., requesón) y productos lácteos coagulados con baja producción de CO₂. Un LD-cultivo se utiliza para hacer queso con tamaños de agujero normales, de productos lácteos cuajados (cuajada) y mantequilla ácida. Comercialmente, LD-cultivos son habitualmente uno de los cultivos mezclados más usados.

Ejemplos de cultivos comerciales termofílicos mezclados incluyen:

"Cultivo de yogur" comprendiendo Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subesp. bulgaricus, y

"Cultivo de queso termofilico" comprendiendo Streptococcus thermophilus y Lactobacillus helveticus.

Un cultivo de yogur se utiliza para hacer yogur y quesos italianos especiales, el cultivo de queso termofílico se utiliza para hacer queso Emmental y quesos italianos especiales.

Además, especies de Propionibacterium son frecuentemente usadas como cultivos lácteos iniciadores, particularmente en la producción de queso. También organismos del género Brevibacterium y del género Bifidobacterium son comúnmente usados como cultivos iniciadores alimenticios.

Otro grupo de cultivos iniciadores microbianos son los cultivos fúngicos, incluyendo cultivos de levadura y cultivos de hongos filamentosos, que son útiles en la producción de tipos determinados de queso y bebida. Ejemplos incluyen Penicillium roqueforti, Penicillium candidum, Geotrichum candidum, Torula kefir, Saccharomyces kefir y Saccharomyces cerevisiae.

Cultivos iniciadores son también muy usados en la industria de procesamiento de la carne, por ejemplo para la fabricación de varias salchichas y salamis.

Cultivos iniciadores comerciales son comúnmente distribuidos como cultivos congelados. A baja temperatura de los cultivos congelados, muchas actividades metabólicas en la célula cesan y las células se pueden mantener en este estado suspendido, aunque viable, durante largos períodos extensos.

Cultivos concentrados congelados son comercialmente muy interesantes puesto que los cultivos se pueden inocular directamente en el recipiente de producción. Usando cultivos concentrados congelados el usuario final evita la, de lo contrario obligatoria, fase de fermentación intermedia que requiere mucho tiempo durante la cual el cultivo iniciador es amplificado, y el usuario final reduce el riesgo de contaminación significativamente. Cultivos concentrados, pueden ser referidos como cultivos DVS - direct vat set^TM.

Como una alternativa a los cultivos concentrados congelados, cultivos DVS^TM concentrados liofilizados pueden ser preparados. Estos cultivos tienen una ventaja adicional en cuanto que pueden ser transportados sin refrigeración.

En general, posibles efectos perjudiciales de congelación y descongelación en la viabilidad de células vivas han sido asignados a la deshidratación de las células y la formación de cristales de hielo en el citosol durante la congelación.

Se han encontrado varios agentes crioprotectores que efectúan la concentración del citosol de una manera controlada y mínimamente injuriosa de modo que la cristalización de hielo en el citosol se excluye o minimiza durante la congelación.

Un artículo...

1. Cultivo congelado o liofilizado, que comprende uno o más agente/s crioprotector/es seleccionado/s del grupo que consiste en uno o más compuesto/s implicado/s en la biosíntesis de ácidos nucleicos o uno o más derivado/s de cualquiera de tales compuestos; y

donde uno o varios agente/s crioprotector/es es/son seleccionado/s del grupo que consiste en bases de purina, bases de pirimidina, nucleósidos y nucleótidos; y

donde el cultivo comprende de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 20% del agente crioprotector o una mezcla de agentes medidos como % p/p del material congelado; o en el caso de que el cultivo sea un cultivo liofilizado el agente crioprotector o mezcla de agentes está/n presente/s en una cantidad de 0.8% a 55% en peso; y

donde el cultivo comprende uno o más organismos seleccionados del grupo que consisten en Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp.; Enterococcus spp., Pediococcus spp., Leuconostoc spp., o Oenococcus spp.

2. Cultivo según la reivindicación 1, donde uno o varios agente/s crioprotector/es es un nucleótido.

3. Cultivo según la reivindicación 1, donde uno o varios agente/s crioprotector/es es/son seleccionado/s del grupo de nucleótidos de pirimidina e inosina.

4. Cultivo según la reivindicación 3, donde uno o varios agente/s crioprotector/es es/son seleccionado/s del grupo que consiste en IMP, UMPy CMP.

5. Cultivo según la reivindicación 3, donde el agente crioprotector comprende inosina-5'-monofosfato (IMP) e inosina.

6. Cultivo según la reivindicación 4, donde el agente crioprotector es inosina-5'-monofosfato (IMP).

7. Cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde uno o varios agente/s crioprotector/es es un agente o una mezcla de agentes, que, además de su crioprotectividad, tiene un efecto impulsor.

8. Cultivo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el cultivo comprende de aproximadamente 2% a aproximadamente 5% del agente crioprotector o mezcla de agentes medidos como % p/p de material congelado.

9. Cultivo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es liofilizado.

10. Cultivo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el cultivo es un cultivo iniciador.

11. Cultivo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende uno o más organismos mesofílicos que tienen temperaturas de crecimiento óptimo a aproximadamente 30ºC.

12. Cultivo según la reivindicación 11, donde el cultivo comprende uno o más organismos mesofílicos seleccionados del grupo comprendiendo Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subesp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subesp. lactis biovar diacetylactis, Lactobacillus casei subesp. casei y Lactobacillus paracasei subesp. paracasei.

13. Cultivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 9-10, que comprende uno o más organismos termofílicos que tienen temperaturas de crecimiento óptimo a aproximadamente 35ºC a aproximadamente 45ºC.

14. Cultivo según la reivindicación 13, donde el cultivo comprende uno o más organismos termofílicos seleccionados del grupo comprendiendo Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subesp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subesp. bulgaricus y Lactobacillus acidophilus.

15. Cultivo según la reivindicación 1, donde el organismo es un Lactococcus spp. que incluye uno o más de Lactococcus lactis subesp. lactis y Lactococcus lactis subesp. cremoris.

16. Cultivo según la reivindicación 1, donde el organismo es un Lactobacillus spp. que incluye Lactobacillus acidophilus.

17. Método para hacer un cultivo congelado según la reivindicación 1 comprendiendo las fases siguientes: