Un péptido de menos de 40 aminoácidos de longitud que comprende la secuencia de amino ácido de SEQ ID NO:

3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, que tiene un sitio de segmentación entre un ácido glutámico en el lado N-terminal del sitio de segmentación y un radical no polar o sin cargar en el lado C-terminal del sitio de segmentación, siendo el péptido segmentable a través de una enzima que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NO:8 y/o SEQ ID NO:9

Sustratos peptídicos de agrecanasa-1 y -2 y métodos asociados.

Campo de la invención

La presente invención describe sustratos de péptido sintéticos de las metaloproteasas, agrecanasa-1 y/o -2, adecuados para su uso en ensayos de actividad enzimática. La invención describe también métodos en los que se utilizan estos péptidos para descubrir agentes farmacéuticos que modulan dichas proteasas.

Antecedentes de la invención

Se sabe que la familia de metaloproteasas desintegrina (o ADAM) de enzimas proteoliticas de superficie celular desempeña un papel en la unión y fusión esperma-óvulo, fusión de la célula del músculo, neurogénesis, modulación del receptor Notch y procesado del ligando y procesado de la citoquina pro-inflamatoria, TNFa (Primakoff and Myles, Trends Genet. 16:83-87, 2000). Se ha demostrado que las ADAMs consisten en dominios pre-, pro-, proteasa, de tipo disintegrina, ricos en cisteína, de tipo factor del crecimiento epidérmico, de transmembrana y citoplásmicos. Los miembros de una nueva subfamilia de ADAMs, las proteínas ADAMTS, carecen del dominio de transmembrana y contienen motivos de trombospondina únicos, que según se cree son mediadores en su unión con la matriz extracelular (Tang and Hong, FEBS Lett 445:223-225, 1999). Según se ha demostrado, dos miembros de la familia ADAMTS, en concreto ADAMTS-4 y -5 (también denominado ADAMTS-11), tienen capacidad de segmentar agrecano. El agrecano es un importante proteoglicano de cartílago (Abbaszade y cols., J. Biol.. Chem. 274:23443-23450, 1999; Tortorella y cols., Science 284: 1664-1666, 1999). Como resultado, se han relacionado estas proteínas con las lesiones de cartílago asociadas con osteoartritis y con enfermedades de las articulaciones inflamatorias, y se las ha denominado "agrecanasa-1" (Nº de acceso en el Genbank 005099) y "Agrecanasa-2" (Genbank NM 007038), respectivamente.

Se ha demostrado que las agrecanasas y MMPs segmentan agrecano en una serie de sitios diferentes (Pratta y cols., J. Biol.. Chem. 275:39096-39102, 2000; Sandy y cols., Biochem. J. 351:161-166, 2000; Tortobella y cols., J. Biol. Chem. 275: 18566-18573, 2000). Se ha demostrado que los productos que son el resultado de la segmentación de agrecano en el sitio Glu373-Ala374, en el dominio interglobular de agrecano, se acumulan en el fluido sinovial de los pacientes con osteoartritis y enfermedad de las articulaciones inflamatoria (Lohmander y cols., Artritis Rheum. 36:1214-22, 1993).

Aggrecanasa-1 y -2, pero no MMPs, son capaces de segmentar agrecano en este sitio. Un péptido de 40 aminoácidos que representa la secuencia de agrecano que rodea el sitio de segmentación de agrecanasa (Publicación PCT Número WO 00/05256) pudo servir como sustrato para la actividad enzimática de agrecanasa; no obstante, ningún péptido de menos de 40 aminoácidos de longitud funcionó como sustrato adecuado para la actividad de agrecanasa, lo que sugiere que sustratos más cortos, como los sustratos de 20 aminoácidos de longitud, no funcionan. Los limites de tamaño mínimo para los sustratos de agrecanasa se corresponden con los estudios que sugieren que la actividad de agrecanasa es sensible al truncado amino terminal de agrecano (Horber y cols., Matrix Biol. 19:533-543, 2000). Asimismo, se ha demostrado que la glicosilación del sustrato de agrecano afecta a la actividad de agrecanasa (Pratta y cols., J. Biol., Chem. 275:39096-39012.2000).

Un ensayo especifico y sensible para la determinación de metaloproteasas de degradación de agrecano, adecuado para una selección de alto rendimiento podría ser útil para identificar inhibidores de estas enzimas para obtener agentes terapéuticos potenciales contra lesiones de cartilago asociadas con osteoartritis y enfermedad de las articulaciones inflamatoria. La presente invención se refiere a péptidos de aminoácido de menos de 40 aminoácidos, no relacionados con la secuencia de agrecano, pero que contienen sitios sensibles a agrecanasa y a su uso en ensayos adecuados para formatos de HTS.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a péptidos de menos de 40 aminoácidos de longitud que tienen un sitio de segmentación entre un ácido glutámico en el lado N-terminal del sitio de segmentación y un radical no polar o sin carga en el lado C-terminal del sitio de segmentación y siendo el péptido segmentable a través de una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 (Agrecanasa-1) y/o SEQ ID NO: 9 (Agrecanasa-2). En otro aspecto de este modo de realización, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. Preferiblemente, el péptido es de origen natural o sintético. En un aspecto preferible de este modo de realización, el péptido comprende una etiqueta detectable seleccionada del grupo que consiste en ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ³²P, ³³P, un colorante fluorescente, o un indicador colorimétrico. El péptido comprende también preferiblemente un fluoroforo y un extintor de fluorescencia o un aceptor localizado en los extremos opuestos del sitio de segmentación del péptido. En un modo de realización, el péptido comprende además una fracción de afinidad localizada en los extremos opuestos del sitio de segmentación del péptido.

En otro modo de realización, la invención se refiere a un método de identificación de un compuesto que inhibe la actividad enzimática de Agrecanasa que comprende las etapas de: poner en contacto un compuesto de ensayo, una agrecanasa, y un péptido de menos de 40 aminoácidos de longitud, comprendiendo el péptido un sitio de segmentación entre un ácido glutámico en el lado N-terminal del sitio de segmentación y un radical de aminoácido sin carga o no polar en el lado C-terminal del sitio de segmentación, y siendo el péptido segmentable a través una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8; y detectar la segmentación del péptido, indicando la inhibición de la segmentación del péptido en presencia del un compuesto de ensayo la inhibición del compuesto de actividad enzimática de agrecanasa. En un aspecto preferible de este modo de realización, el método se lleva a cabo en un recipiente de reacción único. Preferiblemente, la enzima se selecciona del grupo que consiste en agrecanasa-1, o agrecanasa-2. Preferiblemente, el péptido se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5; SEQ ID NO: 6; y SEQ ID NO:7. Preferiblemente, el péptido comprende además una etiqueta detectable seleccionada del grupo que consiste en ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ³²P, ³³P, un colorante fluorescente o un indicador colorimétrico. El péptido comprende preferiblemente además un fluoroforo y un extintor de fluorescencia o aceptor localizado en los extremos opuestos del sitio de segmentación del péptido. En uno de los aspectos de este modo de realización, la etapa de contacto comprende además una célula que expresa agrecanasa.

En otro aspecto de la presente invención, la invención se refiere a un método para detectar la capacidad de un compuesto para inhibir la actividad enzimática de agrecanasa-1 o agrecanasa-2 que comprende las etapas de contacto de un compuesto de ensayo, una agrecanasa secretada por una célula y un péptido que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO: 4; la incubación del compuesto, la enzima y el péptido para dar cabida a la segmentación enzimática del péptido; y la medida de la segmentación enzimática del péptido, llevándose a cabo el método en un recipiente de reacción único sin posterior manipulación. Preferiblemente, el péptido comprende una etiqueta detectable seleccionada del grupo que consiste en ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ³²P, ³³P, un colorante fluorescente o un indicador colorimétrico. También preferiblemente, el péptido comprende un fluoroforo y un extintor de fluorescencia o aceptor localizado en extremos opuestos del sitio de segmentación del péptido.

En otro aspecto más de la presente invención, la invención se refiere a un método para identificar un compuesto capaz de inhibir la actividad de agrecanasa que comprende las etapas de: proporcionar un péptido que comprende una fracción de afinidad, una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO: 4 y una etiqueta detectable, estando dicha fracción de afinidad y etiqueta localizados en lados opuestos de un sitio de segmentación codificado por una secuencia...

1. Un péptido de menos de 40 aminoácidos de longitud que comprende la secuencia de amino ácido de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, que tiene un sitio de segmentación entre un ácido glutámico en el lado N-terminal del sitio de segmentación y un radical no polar o sin cargar en el lado C-terminal del sitio de segmentación, siendo el péptido segmentable a través de una enzima que tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NO:8 y/o SEQ ID NO:9.

2. El péptido de la reivindicación 1, comprendiendo el péptido la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO:4.

3. El péptido de la reivindicación 1 ó 2, siendo dicho péptido de origen natural o sintético.

4. El péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dicho péptido ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ³²P, ³³P, un colorante fluorescente, o un indicador colorimétrico como etiqueta detectable.

5. El péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicho péptido un fluoroforo y un extintor de fluorescencia o aceptor localizado en los extremos opuestos del sitio de segmentación del péptido.

6. El péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo además dicho péptido una fracción de afinidad localizada en los extremos opuestos del sitio de segmentación del péptido.

7. Un método para identificar un compuesto que inhibe la actividad enzimática de agrecanasa que comprende las etapas de:

contacto de un compuesto de ensayo, una agrecanasa y un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

detección de la segmentación del péptido, indicando la inhibición de la segmentación del péptido en presencia del compuesto de ensayo la inhibición de la actividad enzimática de agrecanasa.

8. El método de la reivindicación 7, llevándose a cabo dicho método en un único recipiente de reacción.

9. El método de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, siendo la enzima agrecanasa-1 o agrecanasa 2.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, comprendiendo además la etapa de contacto una célula que expresa agrecanasa.