PROTEASA DE ESCISIÓN DEL FACTOR DE VON WILLEBRAND (VWF).

Un ADN que codifica una proteasa que es capaz de escindir un enlace entre los restos Tyr-842 y Met-843 del factor de von Willebrand (vWF),

que comprende una secuencia de nucleótidos según se muestra en ID. SEC. Nº 6

Proteasa de escisión del factor de von Willebrand (vWF)

La presente invención se refiere a un ADN que codifica una proteína plasmática relacionada con el ámbito de los medicamentos. Más particularmente, la presente invención se refiere a un ADN que codifica una proteasa que escinde específicamente el factor de von Willebrand (en lo sucesivo, en el presente documento puede denominarse “vWF”) , que está asociado con la coagulación sanguínea. La proteasa de escisión del vWF codificada por los ADN de la presente invención permite la terapia de reemplazo para pacientes con enfermedades causadas por defectos o disminución de esta proteasa, tales como la púrpura trombocitopénica trombótica (en lo sucesivo, en el presente documento puede denominarse “PTT”) . Además, se prevé el uso del mismo como un nuevo agente antiplaquetario para la prevención de eventos trombóticos.

El vWF se produce en las células endoteliales vasculares o en los megacariocitos y es un factor de coagulación de la sangre en el que una sola subunidad que comprende 2.050 restos de aminoácidos (monómeros de aproximadamente 250 kDa) se une por medio de un enlace S-S para formar una estructura de multímero (con un peso molecular de 500 a 20.000 kDa) . El nivel del mismo en la sangre es de aproximadamente 10 µg/ml, y por lo general un factor de alto peso molecular tiene una actividad específica más elevada.

El vWF tiene dos funciones principales como factor hemostático. Una de las funciones es como proteína vehículo en la que el vWF se une al factor VIII de coagulación sanguínea para estabilizarlo. Otra función es la de formar el tapón plaquetario mediante la adhesión y la aglomeración de las plaquetas en el tejido endotelial subcelular vascular de la pared del vaso dañado.

La púrpura trombocitopénica trombótica es una enfermedad que causa la formación de trombos hemostáticos en arteriolas somáticas y capilares sanguíneos de todo el cuerpo. A pesar de los recientes avances en tecnología médica, la morbilidad asociada con esta enfermedad prácticamente se triplicó desde 1971 hasta 1991. Desde el punto de vista patológico, se considera que la PTT es el resultado de la citotoxicidad endotelial vascular o la agregación plaquetaria vascular. Desde el punto de vista inmunohistológico, se reconoce una gran cantidad de vWF en los trombos hemostáticos resultantes, y se considera que el vWF desempeña un papel importante en la formación de los mismos. En un paciente con PTT la forma dominante es la estructura de multímero de vWF de peso molecular normal o alto, y se deduce que una estructura de multímero del vWF inusualmente grande (ULvWFM) o de multímero del vWF grande (LvWFM) desempeña un papel importante en la aceleración de la agregación plaquetaria o la formación de microtrombos en condiciones de alto esfuerzo de cizallamiento. En contraste, se sabe que el vWF es degradado en una posición entre los restos Tyr 842 y Met 843 por la acción de la proteasa de escisión del vWF en la sangre circulante de una persona sana en condiciones de alto esfuerzo de cizallamiento. Por consiguiente, se considera que la PTT se produce de la siguiente manera. Por alguna razón, se reduce la actividad de las proteasas en el plasma y aumentan los ULvWFM a LvWFM, lo que causa una aceleración de la agregación plaquetaria. Esto forma trombos hemostáticos en los vasos sanguíneos.

Recientemente, Furlan y col. (Blood, vol. 87, 4223-4234: 1996, publicación de patente JP (Kohyo) Nº 2000-508918) y Tsai y col. (Blood, vol. 87, 4235-4244: 1996) desarrollaron un procedimiento para ensayar la proteasa de escisión específica del vWF. En su informe, la actividad de la proteasa en efecto se redujo en la PTT. Los autores anteriormente mencionados informaron que esta enzima es una metaloproteasa en el plasma y está parcialmente purificada. Sin embargo, aún no han tenido éxito en la secuenciación de aminoácidos que especifique la proteasa. No ha habido otros progresos desde entonces.

Hasta la fecha, se ha realizado la terapia de plasmaféresis para el tratamiento de los pacientes que tienen carencia congénita de proteasa de escisión específica del vWF y de los pacientes que han adquirido anticuerpos positivos contra esta proteasa. Resulta deseable el establecimiento de la terapia de reemplazo con productos purificados o con una sustancia pura, tal como un producto genético recombinante de la proteasa anteriormente mencionada. Los pacientes con PTT familiar congénita carecen de la proteasa específica de vWF, mientras que la causa de la PTT no familiar se debe a la producción a posteriori de autoanticuerpos contra la proteasa anteriormente mencionada. Por consiguiente, resulta de preferencia la terapia de reemplazo de esta proteasa para los pacientes con PTT familiar (de hecho, se realiza la administración plasmática) y la eliminación de los anticuerpos mediante plasmaféresis y la sustitución de esta proteasa son necesarias para la PTT no familiar. Además, también se prevé el uso de esta proteasa como un nuevo agente antiplaquetario para prevenir eventos trombóticos.

Como se mencionó anteriormente, sin embargo, Furlan y col. (Blood, vol. 87, 4223-4234: 1996, publicación de patente JP (Kohyo) Nº 2000-508918) y Tsai y col. (Blood, Vol. 87, 4235-4244: 1996) han sugerido que la proteasa de escisión del vWF es una metaloproteasa en el plasma. Se informó que estaba parcialmente purificada y concentrada de 1.000 a 10.000 veces a partir del plasma en cuanto a su actividad específica. Incluso bajo estas condiciones, no ha habido ningún avance en el análisis de las propiedades de esta proteasa, tales como la secuencia de aminoácidos de su proteína, durante el período de aproximadamente 5 años que ha transcurrido desde entonces. No se ha obtenido más información biológica específica con respecto a esta proteasa. Según lo informado por Furlan y col., se supone que la proteína de interés es gigantesca, y puede haber varios problemas asociados a la misma. Por ejemplo, se espera que existan formas diversificadas de esta proteasa, tales como diversas moléculas o cofactores que interactúen. En base a la complejidad de los procesos de purificación, a la capacidad de deterioro de la separación por la interacción no específica durante la etapa de purificación, y otros factores, se deduce que es muy difícil aislar e identificar la proteasa de una fracción plasmática por el procedimiento de purificación según Furlan y col.

Bajo las circunstancias anteriores, los presentes inventores han realizado estudios concentrados con el fin de aislar e identificar la proteasa de escisión del vWF. Como resultado, han conseguido aislar y purificar la proteasa de escisión del vWF de interés, que aún no había sido informada. Por lo tanto, han tenido éxito en la identificación de una secuencia de aminoácidos de la proteína madura y de un gen que codifica esta secuencia de aminoácidos.

La proteasa de escisión del vWF codificada por los ADN de la presente invención puede escindir un enlace entre los restos Tyr 842 y Met 843 del vWF. De acuerdo con una forma de realización, esta proteasa tiene un peso molecular de 105 a 160 kDa o de 160 a 250 kDa en SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras. La misma consiste en una cadena polipeptídica Leu-Leu-Val-Ala-Val como una secuencia parcial. De más preferencia, consiste en una cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos parcial del extremo N terminal de una proteína madura, es decir, Ala-Ala-Gly-Gly-Ile-Leu-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Val. Se trata de una sustancia que se caracteriza por las siguientes propiedades.

1) Actividad de escisión del vWF

Según el análisis de la secuencia N terminal del fragmento de escisión, la proteasa codificada por el ADN de la presente invención escinde un enlace peptídico entre los restos Tyr 842 y Met 843.

2) Fraccionamiento por filtración en gel Cuando el fraccionamiento se realiza por cromatografía de filtración en gel utilizando pasta de FI como material de partida, las mayores actividades se recogen en una fracción con un peso molecular de 150 a 300 kDa. Según una forma de realización de la presente invención, se encuentra que una sustancia activa efectivamente obtenida tiene un peso molecular de aproximadamente 105 a 160 kDa en la electroforesis. En consecuencia, la proteasa codificada por los ADN de la presente invención es una sustancia que probablemente forme un dímero o similar, o se una a otra molécula o a una sustancia que pueda ser fácilmente degradada o que pueda tener una cadena de azúcar heterogénea añadida.

1. Un ADN que codifica una proteasa que es capaz de escindir un enlace entre los restos Tyr-842 y Met-843 del factor de von Willebrand (vWF) , que comprende una secuencia de nucleótidos según se muestra en ID. SEC. Nº 6.

2. Un ADN que codifica una proteasa que es capaz de escindir un enlace entre los restos Tyr-842 y Met-843 del vWF, que comprende una secuencia de nucleótidos según se muestra en ID. SEC. Nº 15.

3. Un ADN que codifica una proteasa que es capaz de escindir un enlace entre los restos Tyr-842 y Met-843 del vWF, que comprende una secuencia de nucleótidos según se muestra en ID. SEC. Nº 7.

4. Un vector que comprende el ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una célula transformada o transfectada con el vector según la reivindicación 4.

6. Una célula huésped transformada o transfectada con el vector según la reivindicación 4.

7. Una composición farmacéutica que comprende el ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. La composición farmacéutica según la reivindicación 7, para su uso en terapia génica para el tratamiento de la púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) .

9. Un agente de diagnóstico que comprende el ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 15