SISTEMAS DE EMPAQUETADO PARA ADENOVIRUS RECOMBINANTE HUMANO; DESTINADO A TERAPIA GENICA.

Un método para generar una línea celular que es capaz de complementar adenovirus recombinantes con E1 suprimida,

que comprende proporcionar una célula humana con una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias E1 adenovirales que codifican los productos génicos E1A y E1B funcionales y carecen de secuencias pIX, para integrar la molécula de ácido nucleico en el genoma de dicha célula humana y para expresar E1A, E1B 55 kD y E1B 21 kD en dicha célula

Sistemas de empaquetado para adenovirus recombinante humano; destinado a terapia génica.

La invención se refiere al campo de la tecnología del ADN recombinante, más concretamente al campo de la terapia génica. En particular la invención se refiere a la terapia génica en la que se utilizan materiales derivados de adenovirus, en particular adenovirus recombinante humano. Especialmente se refiere a vectores derivados de virus novedosos y líneas celulares de empaquetamiento novedosas para vectores basados en adenovirus.

La terapia génica es un concepto desarrollado recientemente para el cual se pueden y se han ideado una amplia gama de aplicaciones.

En la terapia génica se introduce una molécula que porta información genética en algunas o todas las células de un huésped, como resultado de lo cual se añade información genética al huésped en un formato funcional.

La información genética añadida puede ser un gen o un derivado de un gen, tal como un ADNc, que codifica una proteína. En este caso el formato funcional significa que la proteína puede ser expresada por la maquinaria de la célula huésped.

La información genética también puede ser una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos (ya sea ADN o ARN) presente en la célula huésped. El formato funcional en este caso consiste en que la molécula de ADN (ácido nucleico) añadida o las copias realizadas de la misma in situ sean capaces de emparejar las bases con la secuencia complementaria presente en la célula huésped.

Entre las aplicaciones se incluyen el tratamiento de las alteraciones genéticas suplementando una proteína u otra sustancia que, debido a dicha alteración genética, no se encuentra presente o al menos está presente en cantidades insuficientes en el huésped, el tratamiento de tumores y (otras) enfermedades adquiridas tales como las enfermedades (auto)inmunes o infecciones, etc.

Como puede resultar evidente a partir de lo anterior, existen básicamente tres enfoques diferentes en terapia génica, uno dirigido a compensar una deficiencia presente en un huésped (mamífero); el segundo dirigido a la separación o eliminación de sustancias no deseadas (organismos o células) y el tercero a la aplicación de una vacuna recombinante (tumores o microorganismos foráneos).

Para el propósito de la terapia génica, se han propuesto como vehículos adecuados adenovirus que portan deleciones.

Los adenovirus son virus con ADN sin envuelta. Los vectores de transferencia génica derivados de adenovirus (denominados vectores virales) tienen numerosos rasgos que los hacen particularmente útiles para la transferencia génica con tales fines. Por ejemplo, la biología de los adenovirus está caracterizada con detalle, el adenovirus no está asociado a patologías humanas graves, el virus es extremadamente eficaz al introducir su ADN en la célula huésped, el virus puede infectar una amplia variedad de células y tiene una amplia gama de huéspedes, el virus puede ser producido en grandes cantidades con relativa facilidad, y el virus se puede volver de replicación deficiente mediante deleciones en la región temprana 1 (E1) de genoma viral.

El genoma de los adenovirus es una molécula de ADN de doble hebra lineal de aproximadamente 36.000 pares de bases con la proteína terminal de 55 kDa unida covalentemente al extremo 5' de cada hebra. El ADN de Ad contiene Repeticiones Terminales Invertidas (ITR) idénticas de aproximadamente 100 pares de bases dependiendo de la longitud exacta del serotipo. Los orígenes de replicación virales están localizados en las ITR exactamente en los extremos del genoma. La síntesis de ADN se produce en dos fases. Primero, la replicación se desarrolla mediante desplazamiento de la hebra, generando una molécula dúplex hija y una hebra desplazada parental. La hebra desplazada es de hebra sencilla y puede formar un intermedio denominado "panhandle", que permite el inicio de la replicación y la generación de una molécula dúplex hija. Alternativamente, la replicación puede desarrollarse desde ambos extremos del genoma simultáneamente, obviando el requerimiento de formar la estructura "panhandle". La replicación se resume en la Figura 14 adaptada de (Lechner and Kelly, 1977).

Durante el ciclo de infección productivo, los genes virales son expresados en dos fases: la fase temprana, que es el período hasta la replicación del ADN viral, y la fase tardía, que coincide con el inicio de la replicación del ADN viral. Durante la fase temprana sólo se expresan los productos génicos tempranos, codificados por las regiones E1, E2, E3 y E4, que portan numerosas funciones que preparan la célula para la síntesis de las proteínas estructurales virales (Berk, 1986). Durante la fase tardía se expresan los productos génicos virales tardíos además de los productos génicos tempranos y se disparan la síntesis de ADN y de proteínas de la célula huésped. Por consiguiente, la célula se dedica a la producción de ADN viral y de proteínas estructurales virales (Tooze, 1981).

La región E1 del adenovirus es la primera región del adenovirus expresada después de la infección de la célula diana. Esta región consta de dos unidades transcripcionales, los genes E1A y E1B, ambos requeridos para la transformación oncogénica de cultivos de roedor primarios (embriónarios). Las principales funciones de los productos génicos E1A son:

i) inducir a las células quiescentes a entrar en el ciclo celular y reanudar la síntesis de ADN celular, y

ii) activar transcripcionalmente el gen E1B y las otras regiones tempranas (E2, E3, E4). La transfección de las células primarias con el gen E1A solo puede inducir una proliferación ilimitada (inmortalización), pero no da como resultado una transformación completa. Sin embargo, la expresión de E1A en la mayoría de los casos da como resultado la inducción de la muerte celular programada (apoptosis), y sólo ocasionalmente se obtiene la inmortalización (Jochemsen y col., 1987). La co-expresión del gen E1B es requerida para evitar la inducción de la apoptosis y para hacer que se produzca la transformación morfológica completa. En líneas celulares inmortales establecidas, un elevado nivel de expresión de E1A puede causar la transformación completa en ausencia de E1B (Roberts y col., 1985).

Las proteínas codificadas por E1B ayudan a E1A a redirigir las funciones celulares para permitir la replicación viral. Las proteínas E1B de 55 kD y E4 de 33 kD, que forman un complejo que se localiza esencialmente en el núcleo, funcionan inhibiendo la síntesis de las proteínas del huésped y facilitando la expresión de los genes virales. Su principal influencia consiste en establecer un transporte selectivo de ARNm virales desde el núcleo hasta el citoplasma, simultáneamente al comienzo de la fase tardía de la infección. La proteína E1B de 21 kD es importante para corregir el control temporal del ciclo de infección productivo, evitando de ese modo la muerte prematura de la célula huésped antes de que el ciclo vital del virus se haya completado. Los virus mutantes incapaces de expresar el producto génico E1B de 21 kD manifiesta un ciclo de infección acortado que está acompañado de una degradación excesiva del ADN cromosómico de la célula huésped (fenotipo deg) y un efecto citopático intensificado (fenotipo cyt) (Telling y col., 1994). Los fenotipos deg y cyt son suprimidos cuando además el gen E1A es mutado, indicando que estos fenotipos son una función de E1A (White y col., 1988). Además, la proteína E1B de 21 kDa disminuye la velocidad mediante la cual E1A pone en marcha los otros genes virales. No se sabe todavía a través de qué mecanismo E1B de 21 kD sofoca estas funciones dependientes de E1A.

Los vectores derivados de adenovirus humanos, en los que al menos la región E1 ha sido suprimida y remplazada por un gen de interés, han sido extensamente utilizados para experimentos de terapia génica en fase pre-clínica y clínica.

Como se ha establecido antes, todos los vectores de adenovirus utilizados en la actualidad en terapia génica tienen una deleción en la región E1, donde se puede introducir información genética novedosa. La deleción de E1 vuelve al virus recombinante de replicación deficiente (Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991). Los autores de la presente invención han demostrado que los adenovirus recombinantes son capaces transferir eficazmente genes recombinantes al hígado de rata y al epitelio de las vías respiratorias de monos rhesus (Bout y col., 1994b; Bout y col.,...

1. Un método para generar una línea celular que es capaz de complementar adenovirus recombinantes con E1 suprimida, que comprende proporcionar una célula humana con una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias E1 adenovirales que codifican los productos génicos E1A y E1B funcionales y carecen de secuencias pIX, para integrar la molécula de ácido nucleico en el genoma de dicha célula humana y para expresar E1A, E1B 55 kD y E1B 21 kD en dicha célula.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dichas secuencias E1 adenovirales consisten en los nucleótidos 459-3510 de Ad5.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde las secuencias E1 adenovirales están bajo el control de un promotor PGK.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la moléculas de ácido nucleico comprenden adicionalmente la señal de poliadenilación del Virus de la Hepatitis B aguas abajo de las secuencias E1 adenovirales.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicha célula es una célula diploide.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicha célula es una célula retiniana embrionaria humana.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicha célula es una célula establecida.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, donde dicha célula es una célula A549.

9. Una célula que es susceptible de complementar adenovirus recombinantes con E1 suprimida, estando derivada dicha célula de una célula humana proporcionando a dicha célula humana una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias E1 adenovirales que codifican los productos génicos E1A y E1B funcionales y careciendo de secuencias pIX, donde dicha molécula de ácido nucleico está integrada en el genoma de dicha célula, y donde la célula expresa las proteínas E1A, E1B 55 kD y E1B 21 kD de adenovirus.

10. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9, donde dichas secuencias E1 de adenovirus consisten en los nucleótidos 459-3510 de Ad5.

11. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, donde dicha célula humana es una célula retiniana embrionaria humana.

12. Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que comprende adicionalmente secuencias que codifican E2A.

13. Un método para producir un adenovirus recombinante en una célula, que comprende: