PROTEINAS DE FUSION DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

Un polipéptido de fusión que comprende (i) un antígeno MTB39 (SEC ID Nº 12 o 14),

una variante de dicho antígeno MTB39 que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB39, y (ii) un antígeno MTB32A (SEC ID Nº 2 ó 4), una variante de dicho antígeno MTB32A que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB32A, caracterizado porque dicho antígeno MTB32A, variante o fragmento tiene una sustitución aminoacídica correspondiente a la posición 183 de la SEC ID Nº 4 o a la posición aminoacídica 208 de la SEC ID Nº 2, en la que el residuo de serina encontrado habitualmente en esta posición se ha reemplazado por otro aminoácido

Proteínas de fusión de Mycobacterium tuberculosis.

La presente invención se refiere a proteínas de fusión que contienen al menos dos antígenos de Mycobacterium sp. En particular, se refiere a ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión que incluyen dos o más antígenos individuales de M. tuberculosis que aumentan la sensibilidad serológica de los sueros de individuos infectados con tuberculosis, y a su uso en el diagnóstico, tratamiento y prevención de infección por tuberculosis.

Antecedentes de la invención

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica causada por infección con M. tuberculosis y otras especies de Mycobacterium. Es una enfermedad importante en los países en desarrollo, así como un problema creciente en las zonas desarrolladas del mundo, con aproximadamente 8 millones de casos nuevos y 3 millones de muertes cada año. Aunque la infección puede ser asintomática durante un periodo considerable de tiempo, la enfermedad se manifiesta lo más comúnmente como una inflamación aguda de los pulmones, dando como resultado fiebre y una tos improductiva. Si no se trata, da como resultado típicamente complicaciones graves y muerte.

Aunque la tuberculosis puede controlarse generalmente usando una terapia de antibióticos extendida, dicho tratamiento no es suficiente para prevenir la difusión de la enfermedad. Los individuos afectados pueden ser asintomáticos, pero contagiosos, durante algún tiempo. Además, aunque el cumplimiento del régimen de tratamiento es crítico, el comportamiento del paciente es difícil de monitorizar. Algunos pacientes no completan el curso del tratamiento, lo que puede conducir a un tratamiento ineficaz y al desarrollo de resistencia a fármacos.

Para controlar la difusión de la tuberculosis, la vacunación eficaz y el diagnóstico temprano exacto de la enfermedad son de la máxima importancia. Actualmente, la vacunación con bacterias vivas es el método más eficaz para inducir inmunidad protectora. La micobacteria más común empleada con este fin es el bacilo de Calmette-Guerin (BCG), una cepa avirulenta de M. bovis. Sin embargo, la seguridad y eficacia del BCG es fuente de controversia y algunos países, tales como los Estados Unidos, no vacunan al público general con este agente.

El diagnóstico de la tuberculosis se consigue comúnmente usando un ensayo cutáneo, que implica la exposición intradérmica a tuberculina DPP (derivado de proteína purificado). Las respuestas de linfocitos T específicas de antígeno dan como resultado una induración mensurable en el sitio de inyección durante 48-72 horas después de la inyección, que indica exposición a antígenos micobacterianos. Sin embargo, la sensibilidad y especificidad han sido problemáticos con este ensayo, y los individuos vacunados con BCG no pueden distinguirse de los individuos infectados.

Aunque se ha mostrado que los macrófagos actúan como los efectores principales de la inmunidad por Mycobacterium, los linfocitos T son los inductores predominantes de dicha inmunidad. El papel esencial de los linfocitos T en la protección frente a infección por Mycobacterium se ilustra por la frecuente aparición de infección por Mycobacterium en pacientes de SIDA, debido al agotamiento de linfocitos T CD4⁺ asociado a la infección por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Se ha mostrado que los linfocitos T CD4⁺ reactivos con Mycobacterium son potentes productores de interferón ? (IFN-?) que, a su vez, se ha mostrado que desencadena los efectos antimicobacterianos de los macrófagos en ratones. Aunque el papel del IFN-? en seres humanos está menos claro, los estudios han mostrado que la 1,25-dihidroxivitamina D3, sola o en combinación con IFN-? o factor alfa de necrosis tumoral, activa los macrófagos humanos para inhibir la infección por M. tuberculosis. Además, es conocido que el IFN-? estimula a los macrófagos humanos a preparar 1,25-dihidroxivitamina D3. De forma similar, se ha mostrado que la interleucina-12 (IL-12) desempeña un papel en la estimulación de la resistencia a infección por M. tuberculosis. Para una revisión de la inmunología de infección por M. tuberculosis, véanse Chan y Kaufmann, "Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control" (Bloom ed., 1994) y "Harrison's Principles of Internal Medicine", volumen 1, pág. 1004-1014 y 1019-1023 (14ª ed., Fauci et al., eds., 1998).

En consecuencia, existe la necesidad de reactivos de diagnóstico mejorados y métodos mejorados para el diagnóstico, prevención y tratamiento de la tuberculosis.

Sumario de la invención

Por lo tanto, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende (i) un antígeno MTB39 (SEC ID Nº 12 ó 14), una variante de dicho antígeno MTB39 que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB39 y (ii) un antígeno MTB32A (SEC ID Nº 2 ó 4), una variante de dicho antígeno MTB32A que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB32A, caracterizado porque dicho antígeno MTB32A, variante o fragmento tiene una sustitución aminoacídica correspondiente a la posición 183 de la SEC ID Nº 4 o la posición aminoacídica 208 de la SEC ID Nº 2 en la que el residuo de serina encontrado habitualmente en esta posición se ha reemplazado por otro aminoácido.

En una realización, la presente invención proporciona la proteína de fusión MTB72FMutSA, en la que el componente Ra35 de la proteína de fusión tiene una mutación de serina a alanina en la posición aminoacídica 710 de la secuencia de MTB72F. En otra realización, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión MTB72F, en la que el ácido nucleico que codifica el componente Ra35 se ha mutado, cambiando una T por una G, dando como resultado una mutación de serina a alanina en la posición aminoacídica 710 de la secuencia de MTB72F.

La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento por los inventores de que los polinucleótidos de fusión o polipéptidos de fusión que contienen al menos dos secuencias de codificación heterólogas de M. tuberculosis o antígenos son altamente antigénicos y, tras administración a un paciente, aumentan la sensibilidad a sueros de tuberculosis. Además, los polipéptidos y polinucleótidos de fusión son útiles como herramientas de diagnóstico en pacientes que pueden haberse infectado con Mycobacterium.

Los polipéptidos de fusión y ácidos nucleicos de la invención se usan en ensayos in vitro e in vivo para detectar anticuerpos humorales o inmunidad mediada por célula contra M. tuberculosis para el diagnóstico de infección o la monitorización de la progresión de la enfermedad. Por ejemplo, los polipéptidos pueden usarse como agente de diagnóstico in vivo en forma de un ensayo cutáneo intradérmico. Los polipéptidos pueden usarse también en ensayos in vitro tales como ELISA con suero de paciente. Como alternativa, los ácidos nucleicos y polipéptidos de fusión pueden usarse para crear anticuerpos anti-M. tuberculosis en un animal no humano. Los anticuerpos pueden usarse para detectar los antígenos diana in vivo e in vitro.

Los polipéptidos de fusión y ácidos nucleicos pueden usarse como inmunógenos para generar o provocar una respuesta inmunitaria protectora en un paciente. Se usan polinucleótidos aislados o purificados para producir antígenos de polipéptido recombinante de fusión in vitro, que se administran entonces en forma de vacuna. Como alternativa, los polinucleótidos pueden administrarse directamente a un sujeto en forma de vacunas de ADN para causar la expresión de antígeno en el sujeto y la posterior inducción de una respuesta inmunitaria anti-M. tuberculosis. Por tanto, los polipéptidos y ácidos nucleicos de M. tuberculosis aislados o purificados de la invención pueden formularse en forma de composiciones farmacéuticas para administración a un sujeto en la prevención y/o el tratamiento de infección por M. tuberculosis. La inmunogenicidad de la proteína de fusión o antígenos puede potenciarse mediante la inclusión de un coadyuvante, así como polipéptidos de fusión adicionales, de Mycobacterium u otros organismos, tales como polipéptidos bacterianos, víricos o de mamífero. Pueden incluirse también polipéptidos adicionales en las composiciones, ligados o no ligados al polipéptido de fusión.

Breve descripción...

1. Un polipéptido de fusión que comprende (i) un antígeno MTB39 (SEC ID Nº 12 o 14), una variante de dicho antígeno MTB39 que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB39, y (ii) un antígeno MTB32A (SEC ID Nº 2 ó 4), una variante de dicho antígeno MTB32A que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo o un fragmento inmunogénico de dicho antígeno MTB32A, caracterizado porque dicho antígeno MTB32A, variante o fragmento tiene una sustitución aminoacídica correspondiente a la posición 183 de la SEC ID Nº 4 o a la posición aminoacídica 208 de la SEC ID Nº 2, en la que el residuo de serina encontrado habitualmente en esta posición se ha reemplazado por otro aminoácido.

2. Un polipéptido de fusión de la reivindicación 1, que comprende al menos 195 aminoácidos del extremo N de un antígeno MTB32A (SEC ID Nº 2 ó 4) o una variante de dicho antígeno MTB32A que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo.

3. Un polipéptido de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el residuo de serina correspondiente a la posición aminoacídica 183 de la SEC ID Nº 4 o a la posición aminoacídica 208 de la SEC ID Nº 2 se ha sustituido por alanina.

4. Un polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente un polipéptido que comprende al menos aproximadamente 132 aminoácidos del extremo C del antígeno MTB32A (SEC ID Nº 2 ó 4) o una variante de dicho antígeno MTB32A que tiene al menos un 90% de identidad con el mismo.

5. El polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los antígenos están ligados covalentemente mediante un ligador químico.

6. El polipéptido de fusión de la reivindicación 5, en el que el ligador químico es un ligador aminoacídico.

7. Un polipéptido de fusión de la reivindicación 6, en el que el polipéptido de fusión comprende la secuencia aminoacídica de MTB72FMutSA (SEC ID Nº 18).

8. Un polipéptido de fusión de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente al menos un polipéptido heterólogo adicional de Mycobacterium sp.

9. Un polipéptido de fusión de la reivindicación 8, en el que el antígeno adicional se selecciona del grupo constituido por el antígeno MTB8.4 (SEC ID Nº 22), el antígeno MTB9.8 (SEC ID Nº 24), el antígeno MTB9.9 (SEC ID Nº 27), el antígeno MTB40 (SEC ID Nº 29), el antígeno MTB41 (SEC ID Nº 31), 38-1 (SEC ID Nº 35), TbRa3 (SEC ID Nº 37), 38 kDa (SEC ID Nº 39), DPEP (SEC ID Nº 41), TbH4 (SEC ID Nº 43), DPPD (SEC ID Nº 45), Erd14, el antígeno ESAT-6 (SEC ID Nº 33), el antígeno complejo MTB85 o un antígeno a cristalino o un fragmento inmunogénico de los mismos.

10. Un polipéptido de fusión de la reivindicación 7, en el que el polipéptido de fusión tiene la secuencia aminoacídica de MTB72FMutSA (SEC ID Nº 18).

11. Una composición de vacuna que comprende un polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende adicionalmente un coadyuvante.

12. La composición de vacuna de la reivindicación 11, en la que el coadyuvante comprende QS21 y MPL.

13. La composición de vacuna de la reivindicación 11, en la que el coadyuvante se selecciona del grupo consistente en AS2, ENHANZYN, MPL, 3D-PL, IFA, QS21, CWS, TDM, AGP, CPG, Leif, saponina y miméticos de saponina.

14. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

15. Un polinucleótido según la reivindicación 14, que codifica MTB72FMutSA (SEC ID Nº 18).

16. Un polinucleótido según la reivindicación 15, que tiene la secuencia exhibida en la SEC ID Nº 17.

17. Una composición de vacuna que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, que comprende adicionalmente un coadyuvante.

18. Un polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para uso como un medicamento.

19. Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 para uso como un medicamento.

20. Uso de un polipéptido de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero.

21. Uso de un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero.

22. Un método para la producción de una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo dicho método el uso de una secuencia polinucleotídica que codifica dicha proteína de fusión para dirigir la expresión en una célula hospedadora.