PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION Y PURIFICACION DEL FACTOR DERIVADO DEL EPITELIO PIGMENTADO DE LA RETINA EN UN SISTEMA DE LEVADURA.
Procedimiento de producción y purificación del factor derivado del epitelio pigmentado de la retina en un sistema de levadura.
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir y purificar las moléculas de PEDF y versiones mutadas y/o truncadas de dicha molécula en un sistema de expresión de levadura. También tiene como objeto la protección de las propias moléculas PEDF directamente obtenidas y el uso de las mismas en la preparación de composiciones farmacéuticas. El procedimiento comprende las etapas de obtener el ADN de PEDF al menos a partir de células del epitelio pigmentado de retina, obtener versiones mutantes y/o truncadas, clonar las construcciones en un vector de expresión de levadura, transformar y seleccionar los clones de la levadura, inocular, con los clones obtenidos, el medio de crecimiento de la levadura, inducir el factor PEDF completo o truncado en la levadura, eliminar las células del cultivo mediante centrifugación, cambiar el medio de cultivo en el que están presentes el factor PEDF completo y/o truncado, purificar y aislar
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200600385.
Solicitante: UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA (TITULAR AL 90%)
UNIVERSITAT DE VALENCIA, ESTUDI GENERAL (TITULAR AL 10%).
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: CIUDAD REAL.
Inventor/es: ESCRIBANO MARTINEZ,JULIO, SANCHEZ SANCHEZ,FRANCISCO, FARIAS GOMEZ,ISABEL, RAMIREZ CASTILLEJO,CARMEN, AROCA AGUILAR,JOSE DANIEL.
Fecha de Solicitud: 17 de Febrero de 2006.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 21 de Septiembre de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/81B1
Clasificación PCT:
- A61K38/57 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › que provienen de animales; que provienen de humanos.
- A61P27/02 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › A61P 27/00 Medicamentos para tratar los trastornos de los sentidos. › Agentes oftálmicos.
- C07K14/81 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Inhibidores de proteasa.
- C12Q1/68 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Fragmento de la descripción:
Procedimiento de producción y purificación del factor derivado del epitelio pigmentado de la retina en un sistema de levadura.
Campo de la invención
La presente invención está dentro del campo de la Biología Molecular y la Biotecnología. En particular, la invención se refiere a un procedimiento para producir y purificar la molécula completa de PEDF (Factor Derivado del Epitelio Pigmentado), y versiones mutadas y/o truncadas de dicha molécula en el sistema de expresión eucariota de Pichia pastoris. La presente invención también tiene como objeto la protección de las propias moléculas de PEDF directamente obtenidas mediante este procedimiento y el uso de las mismas en la preparación de composiciones farmacéuticas.
Antecedentes de la invención
El factor PEDF fue inicialmente purificado a partir de medios condicionados de células epiteliales de la retina (Tombran-Tink, J. et al. 1991). PEDF es una proteína que inicialmente fue caracterizada como un inductor y regulador de la diferenciación celular, y se ha propuesto que PEDF podría regular la diferenciación neuronal en la retina embrionaria (Jablonski, M. et al., 1995). También se ha comprobado que PEDF ejerce actividad neurotrófica sobre todo tipo de células de origen neuronal, y además, aumenta la supervivencia de células granulosas del cerebelo en cultivo. También se ha descrito que esta proteína es uno de los factores anti-angiogénicos más potentes (Doll, J.A. et al., 2003) conocidos. Se han descrito en la molécula PEDF dos regiones:
1) Una región amino-terminal, actividad neurotrófica.
2) Una región carboxilo-terminal, con actividad anti-angiogénica.
El aislamiento de PEDF a partir de muestras (humor vítreo, por ejemplo, donde es abundante) es muy complicado debido a la dificultad de disponer de cantidad suficiente de tejido. Además, como se explicará a continuación, los procedimientos actuales de producción de esta proteína presentan importantes inconvenientes. Por ello, nuestro grupo de investigación consideró interesante expresar y purificar tanto la proteína completa como la región carboxilo de la misma, en la levadura Pichia pastoris, con el fin de analizar su posible efecto terapéutico en patologías tales como degeneración macular asociada a la edad, retinopatía diabética, cáncer, enfermedades neurodegenerativas, etc.
La expresión y purificación del factor PEDF ha sido descrita con anterioridad en dos sistemas de producción diferentes:
1) por una parte, se ha descrito su producción en la bacteria Escherichia coli (Becerra SP et al. 1993, JBC):
Sin embargo, la expresión de PEDF en E. coli publicada por este grupo de investigación presenta graves problemas, tales como la no secreción de la proteína PEDF producida, y su no solubilidad (presencia en cuerpos de inclusión), lo que conlleva la incorporación de una serie de pasos en el procedimiento de purificación (por ejemplo, la desnaturalización de la proteína para su purificación, y su consiguiente paso de renaturalización) que hacen a éste mucho más tedioso, además de obtener la proteína en un estado conformacional que puede diferir de su estado normal. Por otra parte, el hecho de producir esta proteína en un organismo procariota, hace que modificaciones post-traduccionales descritas en esta proteína, y que son esenciales para su adecuada actividad (glicosilación, fosforilación), no sean realizadas o lo sean de manera incorrecta, obteniéndose por tanto una variante no "fisiológica" de la proteína. Recientemente ha sido publicado por otro grupo de investigación un procedimiento de producción de PEDF en E. coli (Zhang T et al. 2005, Biotechnology Letters) que solventa los problemas de falta de solubilidad y de secreción que presentaba el procedimiento descrito por Becerra et al. 1993. Este nuevo método incorpora además un paso final de digestión enzimática con el fin de eliminar la molécula de Glutation S-transferasa (GST), fusionada con el extremo c-terminal de PEDF para facilitar la purificación del factor PEDF. Este último paso complica aún más el procedimiento de obtención de PEDF. Aún así, la proteína obtenida en un organismo procariota no es seguro que sea madurada de forma adecuada, y esto puede afectar de forma importante a la estructura y a la actividad de la proteína obtenida.
Por otra parte, en 1996 se describió la producción del factor PEDF en células eucariotas, concretamente, en cultivos de células de riñón de hámster (Stratikos E et al. 1996, Protein Science). La producción de PEDF en este tipo de células eucariotas, solventaba el importante problema de las modificaciones post-traduccionales, aunque incorporaba dos importantes inconvenientes al proceso de producción:
La proteína comercial PEDF es producida en la actualidad principalmente en cultivos de células de riñón de hámster. Debido al elevado coste, este sistema de producción, y a los bajos niveles de proteína obtenida, la presente invención proporciona una nueva alternativa práctica, rápida, eficaz y mucho más económica para producir el factor PEDF. Por tanto, la presente invención propone un método o procedimiento de obtención del factor PEDF en un sistema de expresión diferente a los descritos en el estado de la técnica, fundamentado en la utilización de la levadura Pichia pastoris.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona un nuevo procedimiento para producir el factor PEDF, un equivalente funcional del factor PEDF que contenga sustitución(es), adición(es), inserción(es) y/o deleción(es) únicas o múltiples en la secuencia de la proteína tipo salvaje y/o sustituciones de aminoácidos modificados químicamente que no afecten la función biológica, (así como versiones hiper- e hipo-fosforiladas que corresponden a las secuencias SEQ.ID.N.3, SEQ.ID.N.4, SEQ.ID.N.5 Y SEQ.ID.N.6 respectivamente), y/o versiones truncadas de PEDF en el sistema de expresión eucariota, preferentemente en levaduras y más concretamente en Pichia pastoris.
De acuerdo con la problemática planteada en líneas anteriores, estudios recientes (Maik-Rachline G. and Seger R., Blood., Dec. 2005) han descrito la modificación post-traduccional de PEDF (fosforilación), y cómo esta fosforilación afecta a las diferentes actividades de esta proteína. Como ya se indicado anteriormente, el empleo de células eucariotas para la expresar el factor PEDF favorece la obtención de las diferentes formas fosforiladas (por lo tanto funcionales) del mismo.
Un aspecto muy importante de la presente invención es que la proteína producida en el sistema de Pichia pastoris es totalmente soluble, es secretada al medio de cultivo, y puede ser obtenida con un alto grado de pureza en un único paso cromatográfico, sin necesidad de incorporar ninguna etapa de digestión enzimática en el proceso de purificación.
La ventaja fundamental que presenta el procedimiento descrito en la presente invención respecto al resto de procedimientos ya descritos es conseguir un sistema de producción sencillo y de bajo coste, que puede ser utilizado a nivel industrial para la producción de PEDF.
Por lo tanto, según un primer aspecto importante, esta invención se refiere a un procedimiento...
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para obtener factor PEDF aislado o purificado y/o un equivalente funcional del factor PEDF que contenga al menos una sustitución y/o una adición y/o una inserción y/o una deleción en la secuencia identificada como SEQ ID NO: 1 y/o contenga al menos una sustitución de aminoácidos modificados químicamente y/o versiones truncadas de PEDF en un sistema de expresión de una levadura que comprende las siguientes etapas:
2. Procedimiento según reivindicación 1 donde el sistema de expresión es Pichia pastoris.
3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado porque en la etapa j) el tampón que permite el posterior empleo en estudio de actividad es tampón PBS.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque en la etapa a) los cebadores empleados se seleccionan de la secuencias SEQ.ID.N.7 y/o SEQ.ID.N.8 y/o cualquier cebador equivalente cuya secuencia nucleotídica solape con las secuencias SEQ.ID.N.7 y/o SEQ.ID.N.8.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque en la etapa b) los cebadores empleados se seleccionan del grupo formado por la secuencias SEQ.ID.N.9, SEQ.ID.N.10, SEQ.ID.N.11, SEQ.ID.N.12, SEQ.ID.N.13, SEQ.ID.N.14, SEQ.ID.N.15, SEQ.ID.N.16, SEQ.ID.N.17, SEQ.ID.N.18, SEQ.ID.N.19, SEQ.ID.N.20, SEQ.ID.N.21, SEQ.ID.N.22 y/o cualquier cebador equivalente cuya secuencia nucleotídica solape con las secuencias SEQ.ID.N.9, SEQ.ID.N.10, SEQ.ID.N.11, SEQ.ID.N.12, SEQ.ID.N.13, SEQ.ID.N.14, SEQ.ID.N.15, SEQ.ID.N.16, SEQ.ID.N.17, SEQ.ID.N.18, SEQ.ID.N.19, SEQ.ID.N.20, SEQ.ID.N.21, SEQ.ID.N.22.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque en la etapa b) tos sitios de restricción utilizados son EcoRI y XbaI.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque se han empleado unas cepas GS-115 y X-33.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 caracterizado porque en la etapa f) la inducción de PEDF en Pichia pastoris se realiza a un intervalo de temperatura entre 25-30ºC.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 caracterizado porque en la etapa e) se ha empleado un 2% de fluoruro de sulfonil fenil metano (PMSF).
10. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.1. sobre toda su longitud.
11. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.2. sobre toda su longitud.
12. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.3. sobre toda su longitud.
13. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.4. sobre toda su longitud.
14. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.5. sobre toda su longitud.
15. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ.ID.N.6. sobre toda su longitud.
16. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque consiste en una secuencia aminoacídica escogida del grupo formado por las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.6, y/o por sus secuencias equivalentes funcionales.
17. Uso del factor PEDF según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 en la preparación de un medicamento.
18. Uso del factor PEDF según reivindicación 11, 14 y 15 en la preparación de una composición química que inhibe el efecto de las secuencias SEQ.ID.N.1, SEQ.ID.N.2 y SEQ.ID.N.3.
19. Uso del factor PEDF según reivindicación 18 en la preparación de una composición que inhibe la diferenciación celular.
20. Uso del factor PEDF según reivindicación 10, 12 y 13 en la preparación de una composición química que estimula la diferenciación celular.
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