Un método para la preparación de IL-10 para administración oral,

que comprende;

i) transformar una planta de cultivo no alimenticia, caracterizada porque no es tóxica, no adictiva y agradable, con un vector que contiene un ácido nucleico que codifica IL-10 humano ligado operablemente con regiones reguladoras 5''y 3'';

ii) seleccionar las plantas de cultivo no alimenticias que expresan IL-10 humano para obtener plantas de cultivo no alimenticias transformadas;

iii) hacer crecer y cosechar dichas plantas de cultivo no alimenticias transformadas; y

iv) obtener tejido de planta que comprende IL-10 humano de dichas plantas de cultivo no alimenticias transformadas

Producción de IL-10 en biorreactor de planta de cultivo no alimenticia.

La presente invención se relaciona con el uso de una planta de cultivo no alimenticia como un Biorreactor. Más específicamente esta invención se relaciona con la expresión de IL-10 para administración oral utilizando plantas de cultivo no alimenticias.

Antecedente de la invención

Las citaciones completas para las referencias aparecen al final de la sección de ejemplos.

Numerosas plantas han probado ser susceptibles a transformación con genes heterólogos y durante algún tiempo el tabaco ha sido el sistema modelo para la transformación de plantas. A pesar del hecho que las biotecnologías enfocadas en la protección del cultivo no han encontrado aplicación en la producción de plantas de cultivo no alimenticias, subsiste un papel principal para tales plantas como Biorreactores. Un ejemplo de una planta de cultivo no alimenticia es el tabaco, que es capaz de producir altos niveles de proteína soluble (proteína de fracción 1, FIP; Woodleif et al 1981) y se han desarrollado sistemas piloto para purificar esta fracción para uso como un complemento dietario alto en proteína (Montanari et al 1993).

Se ha reconocido la expresión de genes de mamífero en varias plantas que incluyen tabaco y Arabidopsis como birreactores no estériles, eficientes, de bajo costo para la producción de proteínas valiosas en la medicina y la industria (Ma y Hein 1995). Recientemente se ha presentado evidencia que demuestra que las cuatro cadenas de la inmunoglobulina secretora se expresan apropiadamente y se ensamblan en plantas y que el anticuerpo es completamente funcional (Ma et al 1995). Adicionalmente, los antígenos bacterianos (Haq et al 1995), y víricos (Mason et al 1996) producidos en tabaco y papa transgénicos inmunizan efectivamente ratones cuando la papa transgénica se administra oralmente. Sin embargo, antes de la administración del tejido de planta obtenido de tabaco transgénico, las proteínas se han purificado parcialmente. Claramente las etapas que involucran procesamiento son indeseables si la facilidad de administración oral se maximiza así como también se minimizan cualesquier costos asociados con la producción.

A partir del punto de vista de la seguridad pública y la normatividad las plantas de cultivo no alimenticias son especies ideales para la producción transgénica de proteínas biológicamente activas. Las plantas de cultivo no alimenticias minimizan el riesgo de pérdida accidental de material de planta transgénica que expresa genes para las proteínas biológicamente activas en la cadena alimenticia humana. Otros sistemas de birreactor de planta con base en canola (Rooijen et al. 1995), papa (Manson et al 1996), arroz y yuca (Ma y Hein 1995) no ofrecen esta ventaja. Adicionalmente, las plantas de cultivo no alimenticias se pueden seleccionar de tal manera que la producción en áreas donde no existen especies de ocurrencia natural minimiza adicionalmente el riesgo de pérdidas de gen en la flora local, un ejemplo de esto sería hacer crecer tabaco en regiones en donde el tabaco no crece en invierno, tal como Canadá. Con cualquier planta de cultivo no alimenticia, se pueden producir proteínas transgénicas utilizando cualquier tejido u órgano de la planta. Sin embargo si la producción de la proteína se basa en las hojas, no en las semillas o tubérculos, y cuando se acopla con el hecho que las hojas se cosechan antes de florecimiento no existe riesgo virtual de plantas de Biorreactor no controladas que ocurren en futuras estaciones de cultivo.

Sin embargo, muchas plantas de cultivo no alimenticias contienen altos niveles de productos de planta secundarios que hacen tejidos de planta obtenidos de estas plantas inadecuadas para administración oral directa. Los estudios más recientes han descrito la administración de proteínas derivadas de tabaco a ratones, sin embargo, las proteínas están en una forma parcialmente purificada. Por ejemplo el estudio por Mason et al (1996) involucra la administración oral directa de antígenos víricos que se expresan en el tubérculo de papa y tabaco. Se alimentan directamente ratones con muestras de tubérculo de papa, aún el antígeno, cuando se obtiene del tabaco, se ha purificado parcialmente utilizando gradientes de sacarosa antes de la administración a los ratones.

Se ha reportado el cultivo de plantas de tabaco que contienen bajos alcaloides (Chaplin 1977), sin embargo, no se ha sugerido el uso de tal una planta como un Biorreactor. Recientemente, ha sido sugerida las alteración específica de los niveles de nicotina dentro del tabaco, por sobreexpresión (es decir incremento) o expresión anticodificante (reducción) de N-metiltransferasa putrescina, una enzima que limita la velocidad involucrada en la ruta biosintética de la nicotina (U.S. 5,260,205, publicada en Noviembre 9, 1993 y U.S. 5,369,023, publicada en Noviembre 29, 1994; inventores Nakatani y Malik). Sin embargo, estos métodos se dirigen a la alteración de los niveles de nicotina de tal manera que los niveles de otros alcaloides que afectan los sabores y aroma del tabaco no se modifican de ninguna forma. Estas plantas no serían adecuadas para uso como una planta de cultivo no alimenticia como se describe aquí, ya que se han reducido los niveles de solo un grupo seleccionado de alcaloides. No se producen actualmente plantas libres de nicotina, ni se sugiere el uso de estas plantas de tabaco modificadas transgénicamente, como un Biorreactor para la síntesis de las proteínas de interés. Sin embargo, se pueden utilizar tales métodos y aumentar con el fin de producir plantas de cultivo no alimenticias cuando se reduce el nivel de alcaloide total. Puede ser útil tal un método para la producción de plantas baja en alcaloides como un Biorreactor para la síntesis de las proteínas de interés como se contempla por esta invención. La CA 2188 220 describe la producción de IL-4 en tabaco.

Así existe una necesidad de proporcionar una planta de cultivo no alimenticia capaz de ser utilizada para preparar proteínas transgénicas de interés adecuadas para administración oral.

Resumen de la invención

La presente invención se relaciona con la producción de una proteína de interés utilizando una planta de cultivo no alimenticia.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para la preparación de IL-10 adecuado para administración oral dentro de una planta de cultivo no alimenticia que comprende, transformar la planta de cultivo no alimenticia con un vector adecuado que contiene un IL-10 humano que codifica un ácido nucleico y las regiones reguladoras apropiadas para asegurar la expresión del ácido nucleico dentro de la planta de cultivo no alimenticia, de tal manera que la planta de cultivo no alimenticia se caracteriza por ser no tóxica, no adictiva, agradable, y que requiere poco o ningún procesamiento antes de la administración oral, seleccionando plantas de cultivo no alimenticias que expresan IL-10 humano para obtener plantas de cultivo no alimenticias transformadas; hacer crecer y cosechar dichas plantas transformadas y obtener tejido de planta que comprende IL-10 humano de dichas plantas transformadas.

Esta invención se relaciona adicionalmente con el método anterior en donde la planta no alimenticia se caracteriza porque tiene un nivel de alcaloide bajo. Esta invención también incluye métodos que utilizan una planta caracterizado porque tiene un bajo nivel de nicotina.

Esta invención también describe el método anterior en donde la proteína de interés incluye proteínas farmacéuticamente activas, tal como reguladores del crecimiento, insulina, interferón y compuestos relacionados, interleuquinas, hormona de crecimiento, eritropoyetina, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, Factor VIII, Factor IX, tPA, anticuerpos, antígenos y cualesquier combinaciones y derivados de los mismos.

Adicionalmente, esta invención incluye el método anterior en donde un vector adecuado contiene un gen de interés junto con regiones reguladoras apropiadas para asegurar la expresión del IL-10 dentro de tejidos de plantas deseadas.

Esta invención también proporciona composiciones que comprenden un tejido de un cultivo no alimenticio que contiene un IL-10 transgénico.

Otro aspecto de una realización de esta invención es un método para el tratamiento de un alimento médico al administrar una cantidad adecuada de la composición anterior que comprende un tejido de una planta de cultivo no alimenticia que contiene como un componente farmacéuticamente activo...

1. Un método para la preparación de IL-10 para administración oral, que comprende;

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico se optimiza para utilización de codón.

3. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2 en donde dicha planta no alimenticia se caracteriza porque tiene bajo nivel de alcaloides.

4. El método de la reivindicación 3 en donde dicha planta de cultivo no alimenticia es una planta de tabaco caracterizada porque tiene un bajo nivel de nicotina.

5. El método de la reivindicación 4 en donde, en dicha etapa de transformación, dicha región reguladora 5' se selecciona del grupo que consiste de promotores ubicuos y específicos de tejido.

6. El método de la reivindicación 5 en donde, en dicha etapa de transformación, dicho ácido nucleico incluye un motivo de retención de retículo endoplásmico.

7. El método de la reivindicación 6 en donde dicho ácido nucleico incluye una secuencia de señal de planta.

8. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde dicho tejido de planta que comprende IL-10 obtenido en dicha etapa de obtención (etapa iv) es para administración oral a un animal.

9. Un método para la preparación de IL-10 que comprende extraer IL-10 de dichas plantas de cultivo no alimenticias transformadas de la reivindicación 1 o reivindicación 2.

10. Una composición de proteína preparada por el método de la reivindicación 1 o reivindicación 2 que comprende IL-10 y componentes de planta.

11. La composición de proteína de la reivindicación 10 en donde el cultivo no alimenticio es tabaco.

12. La composición de proteína de la reivindicación 10 en donde el tejido de planta es de hoja.

13. Una composición de proteína preparada por el método de la reivindicación 9 que comprende IL-10 y componentes de planta solubles.

14. El método de la reivindicación 1 en donde, en dicha etapa de transformación, dicho vector también comprenden secuencias que mejoran la expresión de dicho IL-10.

15. El método de la reivindicación 1 en donde, en dicha etapa de transformación, dicho vector codifica una etiqueta de afinidad.

16. El método de la reivindicación 1 en donde dicho vector también codifica un sitio de división proteolítica.

17. El método de la reivindicación 1, en donde dicha etapa de obtención comprende extraer IL-10 de dicha planta transformada para producir un extracto crudo.

18. El método de la reivindicación 17, en donde dicha etapa de obtención comprende extraer IL-10 de dicha planta transformada y purificar parcialmente dicho IL-10.

19. El método de la reivindicación 4, en donde dicha planta de tabaco comprende de 0.2% a 20% del alcaloide total de Delgold.

20. Uso de una composición de proteína de la reivindicación 10 o reivindicación 13 en la preparación de un medicamento para tratamiento de una insuficiencia médica en un paciente, en donde la insuficiencia médica es enfermedad de Crohn, artritis inducida por colágeno, diabetes, afecciones relacionadas con coagulación sanguínea, afecciones médicas que requieren la estimulación de citoblastos a monocitos/macrófagos, infecciones víricas o regulación de respuestas inmunes.