Un proceso para producir etanol en una bacteria corineforme seleccionada entre el grupo que consiste en Corynebacterium glutamicum ATC C13032,

ATCC13058, ATCC13059, ATCC13060, ATCC13232, ATCC13286, ATCC13287, ATCC13655, ATCC13745, ATCC13746, ATCC13761, ATCC 14020 y ATCC31831; Brevibacterium lactofermentum ATCC13869; Brevibacterium flavum MJ-233(FERM BP-1497) y MJ-233AB-41 (FERM BP-1498), Brevibacterium ammoniagenes ATCC6872; Arthrobacter globiformis ATCC8010, ATCC4336, ATCC21056, ATCC31250, ATCC31738 y ATCC35698 comprendiendo el proceso:

a) transformar la bacteria corineforme con genes de Zymomonas mobilis que codifican piruvato descarboxilasa y alcohol deshidrogenasa, bajo una secuencia reguladora que permite la expresión y

b) cultivar la bacteria transformada en un medio en condiciones que son anaeróbicas mediante lo cual se suprime la proliferación de la bacteria

Proceso para producir etanol usando bacteria corineforme recombinante.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para producir etanol. Particularmente, la presente invención se refiere a un proceso para producir etanol en el que se usan azúcares tales como glucosa como material bruto y, más particularmente, un proceso para producir de forma altamente eficaz etanol en una productividad elevada que consiste en usar una bacteria corineforme que se ha transformado mediante un ADN que contiene un gen que expresa actividad piruvato descarboxilasa (denominada en lo sucesivo en este documento PDC) y, si se desea, un gen que expresa actividad alcohol deshidrogenasa (denominada en lo sucesivo en este documento ADH) bajo una secuencia reguladora que permite la expresión y fermentar un material bruto, azúcares tales como glucosa, en condiciones de producción de etanol en las que esta bacteria no prolifera de forma sustancial para producir etanol, que después se recoge.

Antecedentes de la técnica

Hasta ahora, el etanol se ha preparado mediante síntesis química a través de etileno a partir de fuentes fósiles tales como carbón y petróleo o una fermentación de azúcares a partir de recursos de la biomasa tales como plantas mediante un microorganismo tal como levadura o bacterias. Entre éstos, se ha observado un proceso para producir etanol mediante fermentación usando una fuente de biomasa renovable en vista de problemas de fuentes de energía o ambientales.

Un proceso para producir etanol mediante una fermentación industrial a gran escala convencional es un proceso mediante la fermentación de almidón o azúcares a partir de diversas recursos de la biomasa, concretamente, una tecnología basada en una fermentación para etanol potable. Sin embargo, el uso de una levadura como un microorganismo de fermentación da como resultado una velocidad lenta de producción de etanol y también dificultades tales como un control de la fermentación complicado debido a la necesidad de aireación, aunque la fermentación se realiza en condiciones anaeróbicas.

Es bien conocido el uso de una cepa que pertenece a Zymomonas como un microorganismo de fermentación (Publicación de Patente Japonesa Nº H7-59187).

Se reconoce que un proceso de fermentación mediante el uso de Zymomonas conduce a una velocidad aumentada de producción de etanol en comparación al mismo usando una levadura. Se ha propuesto la mejora de la eficacia de producción de etanol mediante modificación biotecnológica de diversas especies de microorganismos (Publicaciones de Patente Japonesa Nº H5-502366, H6-504436 y H6-505875).

En las tecnologías anteriores, se insertaron dos genes de Zymomonas mobilis, uno que codifica la actividad PDC (que cataliza la conversión de ácido pirúvico en la ruta glicolítica en acetoaldehído) y otra actividad ADH (que cataliza la conversión de acetoaldehído en etanol) en un hospedador (bacteria entérica tal como Escherichia coli o Erwinia chrysanthe) bajo una secuencia reguladora que permite su expresión. Por consiguiente, se consiguió la fermentación de etanol con productividad elevada usando tales transformantes.

Otro enfoque en base a la ingeniería genética de bacterias entéricas que usan genes que codifican PDC y ADH de Zymomonas mobilis se ha descrito por Ingram et al. (Biotechnological Progress (1999) Vol. 15, Nº 5, páginas 855-866). La publicación describe que estos dos genes se han ensamblado en un casete de producción de etanol portátil e integrado en el cromosoma de Escherichia coli B para uso con jarabes obtenidos de hemicelulosa. Sin embargo, el documento sólo se refiere a un proceso para transformar bacterias Gram-negativas con un vector que proporciona una función de expresión de PDC y ADH. Con respecto a las bacterias Gram-positivas, la publicación de Ingram et al. sólo indica que "también se han realizado avances en la ingeniería genética de bacterias Gram-positivas usando los mismos genes con promotores alternativos".

De acuerdo con las tecnologías mencionadas anteriormente, la mejora en la productividad de etanol se debe al crecimiento elevado y la densidad celular elevada de los transformantes en el fermentador. Tal fermentación que implica crecimiento celular presenta muchas ineficacias incluyendo eficacia de conversión baja de material de azúcar en etanol debido a que el material de azúcar se usa como una fuente de suministro de energía para el cultivo de dicho microorganismo, velocidad de producción de etanol baja durante el período hasta que el microorganismo alcanza la fase de crecimiento estacionaria y complicaciones en el control del fermentador debido al cambio de densidad del microorganismo que acompaña el crecimiento celular del mismo.

Otro problema tecnológico es la separación de sustancias tóxicas cuando se usa Escherichia coli como una célula hospedadora. Escherichia coli es sensible a bacteriolisis que conduce a posible contaminación de productos de fermentación con proteína intracelular tóxica.

El documento WO 95/27064 proporciona microorganismos que son capaces de metabolizar nuevas recursos de la biomasa, por ejemplo, lignocelulosa, en etanol. Las bacterias Gram-positivas se transforman con genes heterólogos que confieren a estos microbios la capacidad de producir etanol como un producto de fermentación. Se ilustra la transformación de bacterias con genes, obtenibles a partir de Zymomonas mobilis, que codifican PDC y ADH. Además, las bacterias también se transforman con genes que codifican enzimas que degradan oligosacáridos, especialmente sacarasas.

El documento WO 03/25117 describe nuevos genes de PDC a partir de bacterias. Estas enzimas muestran, por ejemplo, una actividad de piruvato descarboxilasa o afinidad de sustrato superior o se pueden expresar a niveles más altos en el organismo diana.

A partir de este punto de vista, es deseable la mejora de microorganismos hospedadores adicionales que se tienen que transformar y una tecnología para una producción más eficaz de etanol.

Problema que tiene que resolver la invención

La presente invención proporciona un proceso nuevo para producir etanol usando recursos de la biomasa como material bruto para azúcares, en el que se ha conseguido una tecnología excelente mejor para producir eficazmente etanol a una productividad elevada y en el que se han resuelto diversos problemas señalados en la técnica anterior precedente.

Medios para resolver el problema

Los presentes inventores han realizado estudios prolongados para resolver los problemas mencionados anteriormente y han encontrado que la producción eficaz de etanol a una productividad elevada se puede conseguir usando una bacteria corineforme que se ha transformado con un gen que expresa actividad PDC y un gen que expresa actividad ADH bajo una secuencia reguladora que permite la expresión y después, llevando a cabo fermentación en condiciones anaeróbicas de producción de etanol en las que la bacteria corineforme transformada no prolifera de forma sustancial, mediante lo cual se ha conseguido la presente invención.

Una de las características de la presente invención es que una bacteria hospedadora que se tiene que transformar es una bacteria corineforme y que el etanol se prepara en condiciones anaeróbicas en las que la bacteria corineforme transformada no prolifera de forma sustancial.

Realización de la invención

Se usa un gen que expresa actividad ADH y un gen que expresa actividad PDC a partir de Zymomonas mobilis.

Específicamente, se puede usar el siguiente gen, que ya se ha clonado y secuenciado.

Genes que expresan actividad ADH

Zymomonas mobilis de origen:

Gen ADHI (Nº de acc. M32100) (J. Bacteriol. Vol. 172, 2491-2492(1190))

Gen ADHII (Nº de acc. X17065, M15394) (J. Bacteriol. vol. 169,2591-2597(1987)).

Genes que expresan actividad PDC

Zymomonas mobilis de origen:

Gen PDC (J. Bacteriol. vol. 170,3310-3313(1988))

Es necesario que los dos genes estén bajo una secuencia reguladora para expresar su actividad, aunque no se requiere necesariamente que estén bajo una secuencia reguladora común. Los mismos pueden estar bajo secuencias reguladoras separadas y en algunos casos en plásmidos diferentes y en sitios diferentes en un cromosoma.

"Bajo una secuencia reguladora" como se usa en este documento se refiere...

1. Un proceso para producir etanol en una bacteria corineforme seleccionada entre el grupo que consiste en Corynebacterium glutamicum ATC C13032, ATCC13058, ATCC13059, ATCC13060, ATCC13232, ATCC13286, ATCC13287, ATCC13655, ATCC13745, ATCC13746, ATCC13761, ATCC 14020 y ATCC31831; Brevibacterium lactofermentum ATCC13869; Brevibacterium flavum MJ-233(FERM BP-1497) y MJ-233AB-41 (FERM BP-1498), Brevibacterium ammoniagenes ATCC6872; Arthrobacter globiformis ATCC8010, ATCC4336, ATCC21056, ATCC31250, ATCC31738 y ATCC35698 comprendiendo el proceso:

2. El proceso de la reivindicación 1 en el que los genes de Zymomonas mobilis están comprendidos en un vector de expresión.

3. El proceso de la reivindicación 2 en el que el vector de expresión que comprende los genes de Zymomonas mobilis es pKP1-PDC-ADH que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 7 mediante lo cual la bacteria corineforme se transforma.

4. El proceso de la reivindicación 1, en el que la bacteria transformada es Corynebacterium glutamicum pKP1-PDC-ADH/13032.

5. El proceso de la reivindicación 1 en el que la bacteria transformada es Brevibacterium lactofermentum pKP1-PDC-ADH/13869.

6. Un vector de expresión que es pKP1-PDC-ADH que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 7.

7. Una bacteria corineforme que es Corynebacterium glutamicum pKP1-PDC-ADH/13032 (FERM BP-7621).

8. Una bacteria corineforme que es Brevibacterium lactofermentum pKP1-PDC-ADH/130869 (FERM BP-7622).