Un proceso para producir etanol a partir de un medio con mezcla de azúcares que comprende xilosa,

que comprende: (a) proporcionar una cepa de Zymomonas recombinante capaz de utilizar xilosa para producir etanol, comprendiendo dicha cepa al menos una modificación genética en el gen himA que reduce la expresión de la proteína de la subunidad alfa del factor de integración del anfitrión (HimA); y (b) cultivar la cepa de (a) en un medio que comprende xilosa, en el que dicha cepa usa la xilosa como fuente de carbono para producir etanol

REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUD RELACIONADA

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EEUU No. 60/983761, presentada el 30 de octubre, 2007.

DECLARACIÓN DE LOS DERECHOS DEL GOBIERNO

Esta invención se hizo con el apoyo del Gobierno de los Estados Unidos con el Contrato No. 04-03-CA-70224 otorgado por el Departamento de Energía y el Contrato No. DE-AC36-08GO28308 entre el Departamento de Energía de los Estados Unidos y la Alianza para Energía Sostenible, LLC, el Gerente y Operador del Laboratorio Nacional de Energía Renovable. El Gobierno de EEUU tiene determinados derechos en esta invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a los campos de la microbiología y la ingeniería genética. Más específicamente, se encontró que el gen himA, que codifica la subunidad alfa del factor de integración del anfitrión, estaba implicado en la tolerancia al acetato de Zymomonas. Se desarrolló una cepa de Zymomonas que utiliza xilosa con una modificación genética en el gen himA, que presenta una producción mejorada de etanol en presencia de acetato.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La producción de etanol por microorganismos proporciona una fuente de energía alternativa a los combustibles fósiles y, por lo tanto, es un área importante de investigación actual. Zymomonas mobilis es un etanológeno bacteriano que crece en glucosa, fructosa y sacarosa, metabolizando estos azúcares a CO2 y etanol a través de la ruta Entner-Douderoff.

Es deseable usar biomasa lignocelulósica hidrolizada que puede proporcionar un sustrato de carbono disponible de manera abundante y de bajo coste para usarse en la fermentación para la producción de etanol. La xilosa es la pentosa principal en los materiales lignocelulósicos hidrolizados. Aunque las cepas de tipo salvaje de Z. mobilis no pueden usar xilosa como fuente de carbono, se han obtenido por ingeniería cepas recombinantes que son capaces de crecer en este azúcar (EEUU 5514583, EEUU 5712133, WO 95/28476, Feldmann et al. (1992) Appl Microbiol Biotechnol 38: 354-361, Zhang et al. (1995) Science 267: 240-243). Estas cepas están modificadas para la expresión de cuatro enzimas necesarias para el metabolismo de la xilosa: 1) xilosa isomerasa, que cataliza la conversión de xilosa en xilulosa; 2) xiluloquinasa, que fosforila la xilulosa para formar xilulosa 5-fosfato; 3) transcetolasa; y 4) transaldolasa (EEUU 5514583, EEUU 6566107; Zhang et al. (1995) Science 267: 240-243). Equipadas con estas cuatro enzimas y la maquinaria metabólica normal de la célula, tres moléculas de xilosa se convierten en dos moléculas de glucosa 6-fosfato y una molécula de gliceraldehído 3-fosfato, que se convierten posteriormente en etanol y CO2 en la parte de la glucosa de la ruta (Figura 1).

Aunque se ha tenido éxito en la modificación por ingeniería de cepas de Z. mobilis para el metabolismo de la xilosa, las cepas no crecen ni producen etanol tan bien en xilosa como en glucosa. Incluso en circunstancias ideales, el metabolismo de la xilosa es de 3 a 4 veces más lento que el metabolismo de la glucosa (Lawford et al. (2000) Applied Biochemistry and Biotechnology 84-86: 277-293) y la diferencia es mucho mayor en condiciones adversas. Debido al flujo lento del carbono, el nivel de ATP en estado estacionario también es más bajo con el crecimiento en xilosa (Kim et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1): 186-193) y, como resultado, Z. mobilis es mucho más susceptible al estrés y a inhibidores cuando se crece en este azúcar (Joachimsthal et al. (2000) Applied Biochemistry and Biotechnology 84-86: 343-356; Kim et al. (2000) Applied Biochemistry and Biotechnology 84-6: 357-370). Un estrés particular encontrado con el uso de biomasa lignocelulósica hidrolizada para la fermentación es la presencia de acetato (Kim et al. (2000) Applied Biochemistry and Biotechnology 84-86: 357-370) que se libera de los restos de xilosa acetilados en la hemicelulosa durante los procesos de pretratamiento y sacarificación.

El documento FREUNDLICH, M. ET AL.: "The role of integration host factor in gene expression in Escherichia coli" (MOLECULAR MICROBIOLOGY, vol. 6, no. 18, 1992, páginas 2557-2563) describe una cepa de Escherichia coli modificada genéticamente que tiene una expresión génica delecionada de himA o himAD, que da lugar a un crecimiento reducido en presencia de acetato.

Los mecanismos para que Z. mobilis haga frente al estrés relacionado con acetato y otros ácidos orgánicos no se han esclarecido y no hay publicaciones en la bibliografía acerca de genes que jueguen un papel en este proceso. Por lo tanto, actualmente no es una opción el uso de un diseño racional para obtener por ingeniería genética una cepa que tenga una mayor resistencia al acetato. Por otra parte, se han descrito mutantes de Z. mobilis que tienen una mayor tolerancia para el acetato (Joachimsthal et al. (1998) Biotechnol. Lett. 20(2): 137-142; Jeon et al. (2002) Biotechnol. Lett.

24: 819-824; Solicitud de Patente de EEUU 20030162271). Para generar estos mutantes se usó la selección después de mutagénesis química aleatoria con nitrosoguanidina (NTG) pero los genes modificados que eran responsables del fenotipo resistente al acetato no se identificaron en ninguno de estos casos. Tampoco se determinó si se requería una mutación o múltiples mutaciones para un mejor comportamiento en la fermentación en la presencia de acetato. Así, actualmente no se sabe a partir de los estudios citados anteriormente cómo conferir tolerancia al acetato a otras cepas de Z. mobilis usando ingeniería genética dirigida.

Existe todavía una necesidad de identificar a los genes implicados en la tolerancia al acetato que pueden modificarse para producir cepas tolerantes al acetato de Zymomonas para la fermentación de hidrolizado, producido a partir de biomasa lignocelulósica pretratada y sacarificada, para producir etanol.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la producción de etanol usando cepas de Zymomonas que utilizan xilosa que tienen un comportamiento mejorado en presencia de acetato. Los solicitantes han descubierto que la tolerancia al acetato se ve afectada por el gen himA que codifica la subunidad alfa del factor de integración del anfitrión. Una Zymomonas que utiliza xilosa con una modificación genética en el gen himA tiene una tolerancia incrementada al acetato cuando se cultiva en mezclas concentradas de glucosa y xilosa en presencia de acetato. La modificación de himA proporciona una expresión reducida del gen himA endógeno. En estas condiciones, la utilización de xilosa y la producción de etanol son significativamente mayores para la cepa con himA modificado que para una cepa comparable que tiene una expresión normal del gen himA.

De acuerdo con esto, la invención proporciona un proceso para producir etanol a partir de un medio con mezcla de azúcares que comprende xilosa, que comprende:

(a) proporcionar una cepa de Zymomonas recombinante capaz de utilizar xilosa para producir etanol, comprendiendo dicha cepa al menos una modificación genética en el gen himA que reduce la expresión de la proteína de la subunidad alfa del factor de integración del anfitrión (HimA); y

(b) cultivar la cepa de (a) en un medio con mezcla de azúcares que comprende xilosa, en el que dicha cepa usa la xilosa como fuente de carbono para producir etanol.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS Y DESCRIPCIONES DE LAS SECUENCIAS

La invención puede entenderse en su totalidad a partir de la descripción detallada, las Figuras y las descripciones de secuencias adjuntas siguientes que forman una parte de esta solicitud.

La Figura 1 muestra un diagrama de las cuatro enzimas (en recuadros) que se han usado para modificar por ingeniería Z. mobilis para la utilización de xilosa y rutas bioquímicas para la producción de etanol usando xilosa.

La Figura 2 muestra un mapa plasmídico de pMODgap/aada, el plásmido que se usó para generar una biblioteca de inserción de transposón en ZW801-4.

La Figura 3 muestra un gráfico de crecimiento de ZW801-4 en una mezcla concentrada de glucosa y xilosa con dos cantidades diferentes de acetato.

La Figura 4 muestra gráficos de utilización de glucosa, utilización de xilosa y producción de etanol para el cultivo de la biblioteca de mutantes de inserción de transposón enriquecida en comparación con la cepa control, ZW801-4, en medio con 100 g/L de glucosa,... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para producir etanol a partir de un medio con mezcla de azúcares que comprende xilosa, que comprende:

(a) proporcionar una cepa de Zymomonas recombinante capaz de utilizar xilosa para producir etanol, comprendiendo dicha cepa al menos una modificación genética en el gen himA que reduce la expresión de la proteína de la subunidad alfa del factor de integración del anfitrión (HimA); y

(b) cultivar la cepa de (a) en un medio que comprende xilosa, en el que dicha cepa usa la xilosa como fuente de carbono para producir etanol.

2. El proceso según la Reivindicación 1, en el que el cultivo se hace en un intervalo de temperatura de desde aproximadamente 250C hasta aproximadamente 400C en medio con pH en un intervalo que es entre aproximadamente 4,5 y 7,5.

3. El proceso según la Reivindicación 2, en el que la temperatura es entre aproximadamente 300C y 370C.

4. El proceso según la Reivindicación 2, en el que el pH es entre aproximadamente 5,8 y 7,0.

5. El proceso según la Reivindicación 1, en el que la modificación genética es una modificación del gen himA seleccionada del grupo que consiste en inserción, deleción, mutación, cosupresión y expresión de ARN antisentido.

6. El proceso según la Reivindicación 5, en el que la modificación genética hace que el gen himA no sea funcional.

7. El proceso según la Reivindicación 6, en el que la modificación genética es una inserción introducida en el gen himA por recombinación homóloga.

8. El proceso según la Reivindicación 1, en el que la cepa recombinante de Zymomonas es ZW801-4::himA o la cepa AcR#3.

9. El proceso según la Reivindicación 1, en el que el medio comprende además acetato y en el que la cepa recombinante de Zymomonas produce una cantidad incrementada de etanol comparada con su cepa parental de Zymomonas sin modificación genética que reduce la expresión de himA.

10. El proceso de la Reivindicación 9, en el que dicha cantidad incrementada de etanol producida se debe a la resistencia al acetato de la cepa de Zymomonas.

11. El proceso de la Reivindicación 9, en el que el medio comprende al menos aproximadamente 120 g/L de mezcla de azúcares que comprende xilosa, un alcohol de azúcar seleccionado del grupo que consiste en sorbitol, manitol, galactitol, ribitol y una mezcla de éstos en una concentración final que es entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 100 mM y al menos aproximadamente 6 g/L de acetato.

12. El proceso de la Reivindicación 11, en el que el alcohol de azúcar está en una concentración que es entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 20 mM.