PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE UN SISTEMA DE CULTIVO DE ENDOMETRIO AUTOLOGO PARA EL CO-CULTIVO ENDOMETRIO-EMBRION.

Procedimiento de preparación, a partir de una biopsia de endometrio,

de un sistema de cultivo de endometrio autólogo destinado a ser utilizado para el cocultivo endometrio-embrión durante la FIV, dicho sistema de cultivo comprendiendo las células epiteliales y de las células estromales, dicho procedimiento comprendiendo etapas conducente a la obtención:

- una primera fracción endometrial dicha epitelial, conteniendo las glándulas epiteliales proveniente del depósito (residuo) retenido sobre el filtro después de una o varias etapas de lisis de tejido endometrial;

- una segunda fracción endometrial dicha estromal, correspondiente a las líquidos filtrados acumulados obtenidos de las etapas de filtración efectuadas después de una o varias etapas de lisis y comprendiendo como componente mayoritario células estromales, y

- una tercera fracción endometrial dicha mixta comprendiendo una mezcla de glándulas y de células estromales, correspondiendo al residuo de sedimentación de la segunda fracción,

caracterizado por el hecho de que el mencionado procedimiento comprende además en otra etapa de purificación de la mencionada tercera fracción, conducente a la separación des componentes epiteliales y estromales de esta tercera fracción y la puesta en cultivo de la mezcla de estos componentes purificados para obtener un cocultivo mixto

Procedimiento de preparación de un sistema de cultivo de endometrio autólogo para el co-cultivo endometrio-embrión.

La presente invención se refiere al dominio de la fecundación in Vitro y concierne en particular a un procedimiento de preparación de un sistema de cultivo de endometrio autólogo para el cocultivo endometrio-embrión.

La fecundación extracorporal o fecundación in Vitro (FIV) consiste en reproducir en el laboratorio lo que pasa naturalmente en las trompas uterinas: la fecundación y las primeras etapas del desarrollo embrionario. Desde 1978, año de nacimiento de Louise Brown hasta ahora, esta técnica ha permitido el nacimiento de cientos de miles de niños en el mundo.

Para evaluar la tasa de éxito de las técnicas de FIV, varios parámetros son utilizados en la literatura. En referencia al número de punciones para la selección de ovocitos, es posible tener en cuenta:

Es el número de partos con al menos un niño normal vivo que caracteriza probablemente al menos el éxito de las técnicas de FIV, siendo esta tasa del orden del 12 al 15%. Esta tasa es altamente dependiente de la edad de las mujeres afectadas y del número de ciclos de tratamiento y del número de embriones transferidos.

El fracaso de la implantación después del FIV puede ser de origen maternal o embrionario. El fracaso de implantación se ha relacionado, entre otros, a la capacidad de los embriones para llegar a la fase de blastocito en cultivo, que está vinculada a su vez a las condiciones del cultivo.

Básicamente, después de la fecundación in Vitro, el embrión es puesto en medios de cultivo específicos sintéticos elegidos en función del día de cultivo (D1 a D6). El embrión es después vuelto a poner en el útero de la paciente al D2 o D3, es decir al estado de 4 u 8 células después del cultivo en un medio sintético. La tasa de implantación de los embriones mayores de 2 o 3 días sigue siendo débil (del orden de 15% por embrión). Esta débil tasa de implantación puede explicarse en parte por la hipermotricidad uterina y el periodo inapropiado de la transferencia: en efecto, estos embriones son puestos en un entorno inadecuado porque in vivo, los embriones en este estado de desarrollo están aún en las trompas y el embrión no llega al útero hasta el estado de blastocito, es decir 5 días después de la fecundación.

Las técnicas de cocultivo (cultivo de un embrión hasta el estado de blastocito sobre una capa celular que sirve de soporte nutritivo) fueron propuestas por primera vez en humanos en 1989 después de que numerosos estudios hubieran probado en animales desde 1962 que esta técnica mejoraba la tasa de embriones proveniente al estado de blastocito.

Además de la sincronización endometrio-embrión, el hecho de poder cultivar un embrión hasta el estado de blastocito permite seleccionar los embriones con potencial de desarrollo alto y efectuar un diagnóstico preimplantación. Por otro lado, las técnicas de cocultivo de embriones permiten obtener blastocitos de mejor calidad, en relación a los blastocitos cultivados en los medios sintéticos.

Técnicas de cocultivo del embrión hasta el estado de blastocito sobre líneas celulares animales, como las células Vero provenientes del epitelio de riñón de mono verde de África, por ejemplo, han dado resultados mejorados en relación a los resultados de las transferencias precoces D2-D3 en los medios sintéticos. Sin embargo, estas células animales no han sido objeto de ningún procedimiento de validación respecto de la seguridad sanitaria según la legislación en vigor, con el objetivo de una utilización terapéutica. El decreto del 12.01.1999, que fija las reglas de buenas prácticas en A.M.P. (ayuda médica a la procreación) en Francia, precisa que sólo el co-cultivo sobre células autólogas no conlleva riesgos de infección exógenos.

Ante el principio de precaución, el co-cultivo ha sido abandonado en los años 98-99 en la práctica en los laboratorios FIV en beneficio de medios sintéticos. Nuevos medios sintéticos permiten el cultivo del embrión hasta el estado de blastocito, medios llamados (secuenciales), han hecho su aparición. Ninguno de estos medios ha podido sin embargo reproducir el efecto del co-cultivo. En efecto, estudios comparativos entre los blastocitos resultantes de medios secuenciales y aquellos resultantes de co-cultivo muestran que la tasa de blastulación es más importante en co-cultivo (alrededor del 45% contra el 30 a 35%) sea cual sea el monocultivo y que los blastocitos obtenidos son de mejor calidad (número de blastómeros más importante, grado más elevado, tasa de fragmentación disminuida). El efecto positivo de los co-cultivos sobre el desarrollo del embrión está relacionado a las interacciones embrión-células elaboración de citoquinas y/o de los factores embriotoficos y trofoblasticos y a la desintoxicación del medio de cultivo por las células somáticas.

La utilización de un co-cultivo de células somáticas autólogas aparece desde entonces como una solución ideal permitiendo tasas de implantación criadas siempre previniendo la contaminación del embrión con virus exógenos.

Entre estas células somáticas humanas, las células de endometrio ocupan una plaza particular. Son en efecto las células fisiológicas de implantación, lo que las recomienda como el soporte ideal del embrión durante el co-cultivo.

Sistemas de cultivo de endometrio autólogo destinados a ser utilizados para el co-cultivo endometrio-embrión durante la FIV, que consisten en un cultivo de células epiteliales purificadas, son conocidos. Su utilización queda sin embargo limitada, pues el cultivo de células epiteliales de las glándulas es muy frágil, tiene una duración de vida limitada a 2 a 4 días, no soportan más que un solo paso en cultivo y es siempre de débil cantidad.

El Solicitante ha constatado, y es uno de los méritos de la invención, que durante la separación de diferentes fracciones celulares a partir de una biopsia de endometrio, es posible obtener, además de una primera fracción endometrial dicha epitelial (comprendiendo mayoritariamente glándulas) y de una segunda fracción endometrial dicha estromal (comprendiendo mayoritariamente células estromales), una tercera fracción endometrial dicha mixta que conduce, después de la separación y la purificación de las glándulas y células estromales que la componen y la puesta en cultivo, a un cultivo mixto (de células epiteliales y estromales) de cualidad, utilizable para el co-cultivo endometrio-embrión durante la FIV.

La presente invención tiene por finalidad proponer un procedimiento de preparación de un nuevo sistema de cultivo de endometrio autólogo para el co-cultivo endometrio-embrión.

A tal efecto y según un primer aspecto, la invención tiene por objeto un procedimiento de preparación de un sistema de cultivo de endometrio autólogo destinado a ser utilizado por el co-cultivo endometrio-embrión durante la FIV, dicho sistema de cultivo comprendiendo células epiteliales y células estromales, caracterizada en que dicho procedimiento comprende etapas que conducen a la obtención de una primera fracción endometrial dicha epitelial, una segunda fracción endometrial dicha estromal y de una segunda fracción endometrial dicha mixta comprendiendo una mezcla de glándulas y de células estromales y que comprende además una etapa de purificación de dicha tercera fracción.

En una variante de realización, la etapa de purificación de la tercera fracción comprende: a) la obtención de células estromales a partir de la tercera fracción y b) la obtención de glándulas a partir de la tercera fracción y c) la mezcla de células estromales y de las glándulas así obtenidas.

En una variante de realización, la etapa a) de obtención de células estromales a partir de la tercera fracción endometrial dicha mixta comprenden las operaciones de:

a1. la suspensión de dicha tercera fracción endometrial en un medio de cultivo apropiado que permita la obtención de una primera suspensión;

a2. filtración de dicha primera...

1. Procedimiento de preparación, a partir de una biopsia de endometrio, de un sistema de cultivo de endometrio autólogo destinado a ser utilizado para el cocultivo endometrio-embrión durante la FIV, dicho sistema de cultivo comprendiendo las células epiteliales y de las células estromales, dicho procedimiento comprendiendo etapas conducente a la obtención:

- una primera fracción endometrial dicha epitelial, conteniendo las glándulas epiteliales proveniente del depósito (residuo) retenido sobre el filtro después de una o varias etapas de lisis de tejido endometrial;

- una segunda fracción endometrial dicha estromal, correspondiente a las líquidos filtrados acumulados obtenidos de las etapas de filtración efectuadas después de una o varias etapas de lisis y comprendiendo como componente mayoritario células estromales, y

- una tercera fracción endometrial dicha mixta comprendiendo una mezcla de glándulas y de células estromales, correspondiendo al residuo de sedimentación de la segunda fracción,

caracterizado por el hecho de que el mencionado procedimiento comprende además en otra etapa de purificación de la mencionada tercera fracción, conducente a la separación des componentes epiteliales y estromales de esta tercera fracción y la puesta en cultivo de la mezcla de estos componentes purificados para obtener un cocultivo mixto.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la etapa de purificación de la mencionada tercera fracción endometrial comprende: a) la obtención de células estromales a partir de la tercera fracción y b) la obtención de glándulas a partir de la tercera fracción y c) la mezcla de las células estromales y de las glándulas así obtenidas.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que la etapa a) comprende las operaciones de:

a1. la suspensión de la tercera fracción endometrial en un medio de cultivo apropiado que permita la obtención de una suspensión S4;

a2. filtración de la suspensión S4, la cual permita la obtención de un filtrado y de una fracción retenida sobre el filtro FR1;

a3. centrifugación del mencionado filtrado que permita la obtención de un residuo C4 conteniendo células estromales de la tercera fracción endometrial;

a4. recogida del residuo C4 en un medio FIV conducente a la obtención de una suspensión S5 de células estromales de la tercera fracción endometrial.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 o 3, caracterizado por el hecho de que la etapa b) comprende operaciones de:

b1. puesta en cultivo en presencia de factores favoreciendo la adhesión de las células de la fracción retenida FR1 durante una duración suficiente para permitir la adhesión de células estromales, conducente a la obtención de un flotante SN4;

b2. filtración del flotante SN4 y puesta en suspensión de la fracción retenida FR2 así obtenida, conducente a la obtención de una suspensión S6 conteniendo glándulas de la tercera fracción endometrial, en un medio FIV.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 3 y 4, caracterizado por el hecho de que la etapa c) consiste en la mezcla de las suspensiones S5 y S6 para obtener una tercera fracción endometrial purificada.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por el hecho de que comprende además una etapa de puesta en cultivo de las glándulas y las células estromales de la tercera fracción endometrial purificada.

7. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que comprende una etapa suplementaria de condicionamiento del mencionado sistema de cultivo de endometrio autólogo a través de un medio FIV semi sólido, en vista del transporte hacia un laboratorio de Procreación Médica Asistida.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizado por el hecho de que la biopsia habiendo sido tratada inmediatamente después su recepción en el laboratorio, el cultivo de células así obtenida es crioconservada y descongelada alrededor del día de la punción ovocitaria de la paciente.

9. Procedimiento según una cualquier de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que, la biopsia de endometrio habiendo sido crioconservada a la recepción la puesta en cultivo de las glándulas y de las células estromales de la tercera fracción endometrial purificada es realizada aproximadamente el día de la punción ovocitaria de la paciente, después de la descongelación y tratamiento de la mencionada biopsia.

10. Procedimiento, según una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que comprende al menos una etapa de lisis de la biopsia de endometrio.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que la lisis es efectuada con colagenasa.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que la lisis es efectuada de manera mecánica.

13. Sistema de cultivo de endometrio autólogo destinado a ser utilizado para el cocultivo endometrio-embrión durante la FIV caracterizado por el hecho de que comprende células epiteliales y células estromales de la tercera fracción endometrial purificada según el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Utilización del sistema de cultivo de endometrio autólogo, obtenido por la puesta en marcha del procedimiento según las reivindicaciones 1 a 12, para la preparación de cocultivos endometrio-embrión durante la FIV.

15. Sistema de cultivo de endometrio autólogo preparado para el uso, destinado para ser utilizado para el cocultivo endometrio-embrión durante la FIV, caracterizado por el hecho de que comprende: