PREPARACION DE UN PRODUCTO A BASE DE MASA.

Proceso para preparar un producto a base de masa, comprendiendo la adición de una xilanasa a una masa,

la fermentación, y el calentamiento de la masa, donde la xilanasa es un polipéptido con al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos según se muestra en las posiciones 1-182 de la SEC ID nº 2 o está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibrida con la cadena complementaria de nucleótidos 85-630 de la SEC ID nº: 1 bajo condiciones de hibridación que comprenden la prehibridación en una solución de 5 x de SSC, 5 x de solución de Denhardt, un 0.5% de SDS y 100 .mu.g/ml de ADN de esperma de salmón sonicado y desnaturalizado, seguida de la hibridación en la misma solución durante 12 horas a aprox. 45º C., seguidas de dos lavados en 0.1 x de SSC, un 0.5% de SDS durante 30 minutos a una temperatura de 49ºC

Preparación de un producto a base de masa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para preparar un producto a base de masa, y a una xilanasa para su uso en el proceso.

Antecedentes de la invención

K.B. Kubata et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56 (9), 1463-1464 (1992) describe la Xilanasa 1 de Aeromonas caviae ME-1. Su secuencia de aminoácidos fue presentada por T. Suzuki et al. en 1994 a las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ donde recibió el número de accesión Q43993.

WO 0039289 describe una xilanasa de Bacillus subtilis supuestamente adecuada para preparar masa no pegajosa.

Resumen de la invención

Los inventores han identificado una xilanasa a partir de una cepa bacteriana de Paenibacillus pabuli y han descubierto que la xilanasa puede aumentar el tiempo de conservación de los productos horneados. Más específicamente, la xilanasa en combinación con una amilasa maltogénica mejora además la blandura de la miga de pan sin tener efectos perjudiciales sobre la elasticidad.

Por consiguiente, la invención proporciona un proceso para preparar un producto con una base de masa, comprendiendo la adición de una xilanasa con una alta identidad con la SEC ID nº: 2 a una masa, fermentando, y calentando la masa. Más específicamente, la xilanasa es un polipéptido con al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos según se muestra en las posiciones 1-182 de la SEC ID nº: 2 o está codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida bajo las condiciones definidas en la reivindicación 1 con la cadena de nucleótidos complementaria 85-630 de la SEC ID nº: 1.

La invención proporciona además una composición de masa que comprende harina junto con la xilanasa y un aditivo para mejorar el pan y/o la masa comprendiendo la xilanasa en forma de un polvo granulado o aglomerado.

La invención también proporciona un polipéptido que tiene actividad xilanasa. Puede ser un polipéptido codificado por el genoma presente en la DSM 16232 de Paenibacillus que puede amplificarse con los cebadores (SEC ID nº.: 3) y (SEC ID nº.: 4) o que tiene una secuencia de aminoácidos según se muestra en las posiciones 1- 182 de la SEC ID nº 2, o puede ser idéntica a uno de estos en al menos un 95%. El polipéptido también puede codificarse por una secuencia de ácido nucleico que hibrida a 49ºC en 0.1 x de SSC con la cadena de nucleótidos complementaria 85-630 de la SEC ID nº: 1.

De forma alternativa, la xilanasa puede ser un polipéptido conteniendo una secuencia de aminoácidos que puede obtenerse a partir del polipéptido maduro de la SEC ID nº: 2 mediante sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos y un polinucleótido con una secuencia que puede derivarse de la SEC ID nº: 1 mediante sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más nucleótidos.

La invención también proporciona un polinucleótido que codifica la xilanasa, un vector de expresión que comprende el polinucleótido, una célula huésped transformada que comprende el vector, al igual que un método para producir la xilanasa mediante el cultivo del transformante.

Descripción detallada de la invención

Fuente de ADN genómico

El organismo fuente de la xilanasa de la invención es una cepa bacteriana aislada a partir de muestras de tierra recogidas en Nueva Zelanda en 1991. La cepa se clasificó como perteneciente a Paenibacillus pabuli. Los inventores han depositado la cepa según los términos del Tratado de Budapest del 17 de febrero de 2004 como DSM 16232 con el DSMZ - Deutsche Sammlung von Micro-organismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig DE.

Vector de expresión recombinante

El vector de expresión de la invención incluye normalmente secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión de ribosoma, señal de iniciación de traducción, y, opcionalmente, un marcador seleccionable, un terminador de transcripción, un gen represor o diferentes genes activadores. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, o puede estar integrado en el genoma de la célula huésped.

Producción mediante el cultivo del transformante

El polipéptido de la invención puede producirse transformando una célula huésped adecuada con una secuencia de ADN que codifique la enzima de xilanasa, cultivando el organismo transformado bajo condiciones que permitan la producción de la enzima, y recuperando la enzima a partir del cultivo.

El organismo huésped puede ser particularmente una célula procariótica, en particular una célula bacteriana, tal como las bacterias gram positivas incluyendo una célula de Bacillus, p. ej., Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis o una célula de Bacillus alcalofílico, o una célula de Streptomyces, o bacterias gram negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp.

Alineación e identidad

El polipéptido y el polinucleótido de la invención pueden tener identidades con las secuencias descritas de al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98%.

Para los propósitos de la presente invención, los alineamientos e identidades de las secuencias proteínicas se analizan con el programa Vector NTI (Invitrogen Corporation). Los alineamientos se crean usando el algoritmo Clustal W (Nucleic Acid Research, 22 (22): 4673-4680, 1994).

Los parámetros de alineación usados para los alineamientos polipeptídicos son: penalización para el primer residuo en un espacio 10; penalización para residuos adicionales en un espacio 0.1; ninguna penalización para espacios introducidos al final de una secuencia.

Hibridación

Las condiciones adecuadas para determinar la hibridación entre una sonda nucleótida y una secuencia homóloga de ADN o ARN implican el preremojo del filtro que contiene los fragmentos de ADN o el ARN para hibridar en 5 x de SSC (citrato de solución salina estándar) durante 10 min, y la prehibridación del filtro en una solución de 5 x de SSC (Sambrook et al. 1989), 5 x de solución de Denhardt (Sambrook et al. 1989), un 0.5% de SDS y 100 µg/ml de ADN de esperma del salmón sonicado y desnaturalizado (Sambrook et al. 1989), seguidos de una hibridación en la misma solución conteniendo un cebado aleatorio (Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13), una sonda marcada como ³²P-dCTP (actividad específica > 1 x 10⁹ cpm/µg) durante 12 horas a aprox. 45ºC. El filtro se lava entonces dos veces durante 30 minutos en 0.1x de SSC, un 0.5% de SDS a una temperatura de 25ºC, 30ºC, 35ºC, 40ºC, 45ºC, 49ºC o 55ºC. Las moléculas que hibrida la sonda de oligonucleótidos bajo estas condiciones pueden detectarse usando una película radiográfica.

Composición de harina o masa

La composición de harina puede comprender particularmente harina de trigo. Puede ser una mezcla seca que comprenda harina y la xilanasa, particularmente en forma del aditivo anteriormente descrito. La composición de harina también puede ser una masa, la cual puede estar fresca, congelada o pre-horneada. Puede ser una masa laminada.

La xilanasa puede añadirse a la composición de harina o masa en una dosificación de 0.1-10 mg de proteína enzimática por kg de harina, particularmente de 0.2-5 mg/kg.

La masa puede comprender también otros ingredientes de masa convencionales, p. ej. proteínas, como leche en polvo y gluten; huevos (tanto huevos enteros, como yemas de huevo o claras de huevo); un oxidante como p. ej. ácido ascórbico, bromato de potasio, yodato de potasio, (adenosina-desaminasa) de azodicarbonamida o persulfato de amonio; un aminoácido tal como L-cisteína; azúcar; sal, como p. ej. cloruro sódico, acetato de calcio, sulfato de sodio o sulfato de calcio. La masa puede contener grasa (triglicéridos) tal como grasa granulada o manteca.

Enzima adicional

Opcionalmente, se pueden añadir una o más enzimas adicionales a la masa junto con la xilanasa de la invención. La enzima adicional puede ser una amilasa, una enzima lipolítica (p. ej. como se describe en WO 9953769) o una segunda xilanasa.

La amilasa puede ser una alfa-amilasa maltogénica exoactiva. Un ejemplo es una alfa-amilasa maltogénica de la cepa NCIB 11837 de B. stearothermophilus, disponible a través de Novozymes A/S bajo el nombre comercial Novamyl®; descrito...

1. Proceso para preparar un producto a base de masa, comprendiendo la adición de una xilanasa a una masa, la fermentación, y el calentamiento de la masa, donde la xilanasa es un polipéptido con al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos según se muestra en las posiciones 1-182 de la SEC ID nº 2 o está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibrida con la cadena complementaria de nucleótidos 85-630 de la SEC ID nº: 1 bajo condiciones de hibridación que comprenden la prehibridación en una solución de 5 x de SSC, 5 x de solución de Denhardt, un 0.5% de SDS y 100 .mu.g/ml de ADN de esperma de salmón sonicado y desnaturalizado, seguida de la hibridación en la misma solución durante 12 horas a aprox. 45º C., seguidas de dos lavados en 0.1 x de SSC, un 0.5% de SDS durante 30 minutos a una temperatura de 49ºC.

2. Proceso de la reivindicación 1 que además comprende la adición de una alfa-amilasa maltogénica exoactiva a la masa.

3. Composición que comprende harina junto con una xilanasa la cual es un polipéptido con al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos según se muestra en las posiciones 1-182 de la SEC ID nº: 2 o está codificada por una secuencia de ADN que puede hibridar a la cadena complementaria de nucleótidos 85-630 de la SEC ID nº: 1, bajo condiciones de hibridación comprendiendo una prehibridación en una solución de 5 x de SSC, 5 x de solución de Denhardt, un 0.5% de SDS y 100 µg/ml de ADN de esperma del salmón sonicado y desnaturalizado, tenida lugar a continuación la hibridación en la misma solución durante 12 horas a aprox. 45ºC., seguida de dos lavados en 0.1 x de SSC, un 0.5% de SDS durante 30 minutos a una temperatura de 49ºC.

4. Composición de la reivindicación precedente que es una masa.

5. Polvo granulado o aglomerado que comprende una xilanasa la cual es un polipéptido con al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos según se muestra en las posiciones 1-182 de la SEC ID nº 2 o está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que hibrida con la cadena complementaria de los nucleótidos 85-630 de la SEC ID nº: 1, bajo condiciones de hibridación que comprenden una prehibridación en una solución de 5 x de SSC, 5 x de solución de Denhardt, un 0.5% de SDS y 100 µg/ml de ADN de esperma del salmón sonicado y desnaturalizado, seguido por la hibridación en la misma solución durante 12 horas a aprox. 45ºC., seguido de dos lavados en 0.1 x de SSC, un 0.5% de SDS durante 30 minutos a una temperatura de 49ºC.

6. Polipéptido conteniendo actividad xilanasa seleccionado del grupo que consiste en: