SECUENCIAS NUCLEOTÍDICAS PARA LA DETECCIÓN DE ESCHERICHIA COLI ENTEROHEMORRÁGICAS (EHEC).

Ácido nucleico aislado consistente en la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1 o la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 2,

sus secuencias complementarias y los fragmentos de al menos 8 nucleótidos consecutivos de SEQ ID Nº 2 y las secuencias derivadas de SEQ ID Nº 2, que difiere por mutación, inserción, deleción y/o sustitución de una o varias bases y que se hibrida en unas condiciones muy rigurosas con la secuencia SEQ ID Nº2

Secuencias nucleotídicas para la detección de Escherichia coli enterohemorrágicas (EHEC).

La invención tiene por objeto dos secuencias nucleicas de origen plasmídico presentes en las bacterias del grupo Escherichia coli enterohemorrágicas (EHEC), la utilización de dichas secuencias para la búsqueda de las EHEC, sobre todo las que poseen los genes que codifican para los factores de virulencia enterohemolisina e intimina, y más en particular la detección específica del serotipo O157:H7. La invención se dirige igualmente a un procedimiento que pone en práctica dichas secuencias así como a los equipos de detección que las contienen.

Las bacterias del grupo EHEC pertenecen a la familia de Escherichia coli productoras de verotoxinas o VTEC, responsables de síndromes diarreicos cuyas consecuencias pueden ser fatales para el hombre. En particular, las EHEC pueden generar colitis hemorrágicas (CH), y eventualmente la aparición de complicaciones mayores como el síndrome hemolítico y urémico (SHU) o la púrpura trombótica trombopénica (Griffin y Tauxe, Epidemiol. Rev. 13, 1991, 60-98).

Además, la incidencia de estas infecciones en la salud pública es tal que implica un mayor control de los productos alimentarios y de los medios de detecciones rápidas, sobre todo en caso de epidemias.

Se han identificado varios serotipos, pertenecientes al grupo EHEC y se les ha hecho responsables de diferentes focos epidémicos: O157:H7, O26:H11, O111:NM, O103:H2, O145:NM, etc. (Acheson y Keush, ASM News 62,1996, 302-306). Sin embargo, el serotipo O157:H7 es el que se ha aislado más frecuentemente.

Los procedimientos de detección tradicionales consisten en identificar las bacterias o en descubrir las toxinas secretadas por éstas. La detección de E. coli O157:H7 se realiza principalmente sobre la base del serotipado, asociado a la búsqueda de propiedades metabólicas, que comprenden la ausencia de fermentación del sorbitol y/o la ausencia de actividad β-glucuronidasa. Además, no existe ningún procedimiento bacteriológico propio para la detección de EHEC, sino pruebas que permiten orientar el diagnóstico. En particular, la utilización de gelosas suplementadas con sangre o hematíes lavados permite poner de relieve el carácter enterohemolítico, presente generalmente en las EHEC.

De manera general, los procedimientos bacteriológicos e inmunológicos relativos a la detección de E. coli O157:H7 son largos, pesados, relativamente costosos y necesitan una confirmación serológica. Además, estos procedimientos no permiten establecer una identificación de E. coli O157:H7 por las reacciones cruzadas con otros géneros y especies bacterianos, lo que hace difícil la interpretación.

El uso de sondas nucleicas ha aparecido así como una alternativa a estos procedimientos tradicionales. Se han realizado esfuerzos importantes para desarrollar las sondas, capaces de detectar de una manera sensible y específica las bacterias E. coli de tipo EHEC, implicadas en los casos de CH y/o SHU, y cuyo prototipo más extendido es E. coli O157:H7.

En particular, se han publicado sondas o fragmentos, que permiten la detección de los genes responsables de la virulencia de E. coli, denominados todavía factores de virulencia. Sin embargo, ninguno de los factores de virulencia conocido actualmente permite por sí solo identificar cepas patógenas de E. coli O157:H7 o EHEC.

Así, la utilización de sondas o fragmentos nucleicos para la detección de los genes que codifican las verotoxinas (vt1 o st1, vt2 o st2), descrito por numerosos grupos de investigación (Karch y Meyer, J. Clin Microbiol. 27, 1989, 2751-2757; Gannon y col., Appl. Env. Microbiol. 58, 1992, 3809-3815; Begum y col., J. Clin. Microbiol. 31, 1993, 3153-3156; Witham y col., Appl. Env. Microbiol., 62, 1996, 1347-1353), ha demostrado que los genes que codifican las verotoxinas se asocian a las cepas bacterianas patógenas E. coli O157:H7 y otras EHEC, pero también pueden estar presentes en cepas E. coli no patógenas, o eventualmente en otros géneros bacterianos tales como Shigella dysenteriae, Citrobacter freundii, etc.

Asimismo, la proteína de adhesión denominada intimina está implicada igualmente en la virulencia de las bacterias de tipo EHEC. Se han seleccionado sobre todo sondas en el gen correspondiente (eae) por parte de Gannon y col. en J. Clin. Microbiol. 31, 1993, 1268-1274, Louie y col. en Epidemiol. Infect. 112, 1994, 449-461 y Meng y col. en Int. J. Food Microbiol. 32, 1996, 103-113. Sin embargo, aunque este factor de virulencia se asocia estrechamente al grupo de las EHEC, se ha encontrado igualmente en las E. coli enteropatógenas (EPEC) que comprenden el serotipo O55:H7.

Finalmente, se han seleccionado sondas en un plásmido de 60 MDa, que codifica entre otros enterohemolisina, factor de virulencia presente igualmente en numerosas EHEC (Levine y col., J. Infect. Dis. 156, 1987, 175-182; Schmidt y col., Infect. Immun. 63, 1995, 1055-1061). Así, la patente US-5.475.098 se dirige a las secuencias nucleicas contenidas en el operón de la enterohemolisina, correspondiente a los genes hlyA, hlyB y a la región intergénica hlyA-hlyB. Las secuencias oligonucleotídicas reivindicadas permiten una detección específica de EHEC, pero la invención no permite diferenciar E. coli O157:H7 de otras EHEC. Además, la patente US-5.652.102 describe una secuencia nucleica situada en un fragmento de restricción obtenido del plásmido de 60 MDa. Sin embargo, el uso de oligonucleótidos obtenidos de esta secuencia en una reacción en cadena de la polimerasa "Polymerase Chain Reaction" (PCR), no permite por sí sola la identificación específica del serotipo O157:H7, y necesita en consecuencia el uso conjunto de cebadores que amplifican los genes que codifican para las verotoxinas y la intimina.

El plásmido pO157, aislado de una cepa E. coli O157:H7 que proviene de una muestra clínica, ha sido descrito últimamente en su totalidad (Makino y col., DNA Research 5, 1998, 1-9). Una cartografía del plásmido que representa la ordenación de los diferentes genes en el genoma del plásmido indica la presencia de 186 fases de lectura abiertos (ORF). Sin embargo, la ausencia de datos de la secuencia nucleica (datos no disponibles en el momento de la aparición del artículo), no permite en ningún caso identificar una región de interés de diagnóstico para la detección específica de E. coli O157:H7.

Últimamente, la solicitud de patente WO-97/32.045 se dirige a oligonucleótidos seleccionados a partir de una secuencia cromosómica obtenida por el procedimiento RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), que conduce a la detección de aproximadamente el 99,5% de E. coli O157:H7, pero las secuencias nucleicas reivindicadas detectan igualmente cerca del 3% de E. coli no EHEC, lo que no es satisfactorio en términos de especificidad, sobre todo en el campo agroalimentario.

El principal inconveniente de todos estos sistemas de detección reside así en el hecho de que ninguno de ellos permite establecer de manera clara y sencilla la identificación del serotipo E. coli O157:H7. En la práctica, muy a menudo es necesario asociar varios sistemas de amplificación y/o de detección para hacer preciso el resultado. Los protocolos utilizados son así difíciles de poner en práctica (amplificaciones múltiples, simultáneas) y los resultados obtenidos en cuanto a sensibilidad y a la especificidad son altamente dependientes, no sólo de las dianas nucleicas usadas, sino también de las condiciones operativas.

Ahora bien, como se ha indicado anteriormente, este serotipo puede provocar graves síndromes que pueden conducir a la muerte, lo que implica tener medios rápidos y fiables de detección, en especial en caso de epidemia.

Los trabajos de los inventores han consistido en investigar secuencias específicas a partir de un banco genómico de E. coli O157:H7, lo que permite el reconocimiento de los principales serotipos de E. coli patógenas para el hombre, y más en particular O157:H7. El banco se ha cribado frente a E. coli enteropatógena O55:H7, supuesto ancestro del serotipo O157:H7, siendo los dos genomas extremadamente cercanos según los análisis de polimorfismo realizados por T. Whittam y col. en Infect. Immun. 61, 1993, 1619-1629.

Estos...

1. Ácido nucleico aislado consistente en la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1 o la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 2, sus secuencias complementarias y los fragmentos de al menos 8 nucleótidos consecutivos de SEQ ID Nº 2 y las secuencias derivadas de SEQ ID Nº 2, que difiere por mutación, inserción, deleción y/o sustitución de una o varias bases y que se hibrida en unas condiciones muy rigurosas con la secuencia SEQ ID Nº 2.

2. Ácido nucleico aislado que consiste en un fragmento de al menos 14 nucleótidos consecutivos de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1, o de una secuencia derivada de la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1, que difiere por deleción y/o sustitución de una o varias bases y que se hibrida en unas condiciones muy rigurosas con la secuencia SEQ ID Nº 1, comprendiendo dicho fragmento o dicha secuencia derivada un encadenamiento nucleotídico resultante de la asociación estable de al menos una parte de la secuencia de inserción IS91 y al menos una parte de la secuencia del gen katP.

3. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1 ó 2, que comprende al menos 14 nucleótidos consecutivos del encadenamiento de la secuencia SEQ ID Nº 1, que incluyen los nucleótidos de la posición 400 a 407.

4. Ácido nucleico aislado que comprende al menos 8 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEQ ID Nº 2, o de la secuencia complementaria y de secuencias derivadas de SEQ ID Nº 2, tales como las definidas en la reivindicación 1.

5. Ácido nucleico según la reivindicación 4 que comprende al menos 14 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEQ ID Nº 2.

6. Ácido nucleico aislado según una de las reivindicaciones 3 a 5, elegido entre las secuencias nucleotídicas siguientes:

7. Pares de ácidos nucleicos aislados, utilizados como cebadores, elegidos entre los pares siguientes de secuencias siguientes:

8. Plásmidos pDF3 y pDF4 depositados en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos respectivamente con los números 1 a 1.999 y 1 a 2.000, el 26 de marzo de 1998.

9. Célula hospedadora que comprende un plásmido según la reivindicación 8.

10. Procedimiento de detección de una E. coli enterohemorrágica (EHEC) en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento la detección de una cadena nucleotídica de secuencia SEQ ID Nº 2 con un ácido nucleico aislado según se define en la reivindicación 4, siendo la presencia de dicha cadena nucleotídica reveladora de la presencia de una EHEC.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la secuencia de dicho ácido nucleico aislado se selecciona del grupo que consistente en:

12. Procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que dicho ácido nucleico aislado es utilizado como cebador y/o sonda.

13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en el que dicho ácido nucleico está marcado.

14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en el que dicho ácido nucleico aislado está inmovilizado en un soporte.

15. Procedimiento de detección de EHEC en una muestra, que comprende las etapas siguientes:

16. Procedimiento según la reivindicación 15, según el cual la etapa (c) comprende las subetapas siguientes:

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que la sonda de captura se fija a la superficie de un pocillo de una placa de microvaloración.

18. Procedimiento según la reivindicación 16 ó 17, en el que la sonda de detección está marcada con peroxi- dasa.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque la puesta en relieve de la actividad de la peroxidasa ligada a la sonda de detección que ha reaccionado, se efectúa por reacción colorimétrica, en presencia de un sustrato cromógeno, tal como la tetrametilbencidina (TMB), por la puesta en práctica de las etapas siguien- tes:

- adición del sustrato cromógeno, tal como una solución de TMB en los pocillos que contienen la mezcla de reacción,

- incubación, en oscuridad, durante un tiempo suficiente para permitir el desarrollo de la coloración,

- bloqueo de la reacción por adición de una solución de parada,

- determinación de la densidad óptica para una longitud de onda apropiada.

20. Procedimiento de detección de las EHEC, según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, poniendo en práctica los oligonucleótidos siguientes:

- las secuencias SEQ ID Nº 21 y SEQ ID Nº 22, como cebadores para la amplificación,

- la secuencia SEQ ID Nº 25 como sonda de captura, y

- la secuencia SEQ ID Nº 27, como sonda de detección.

21. Procedimiento de detección de E. coli O157:H7 en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento la detección de una cadena nucleotídica que resulta de la asociación estable de al menos una parte de la secuencia de inserción IS91 y al menos una parte de la secuencia del gen katP con ayuda de un ácido nucleico aislado que comprende al menos 8 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEQ ID Nº 1, de la secuencia complementaria de ésta o de una secuencia derivada de ésta, que difieren por deleción y/o sustitución de una o varias bases y que se hibridan en unas condiciones muy rigurosas con la secuencia SEQ ID Nº 1, siendo la presencia de dicha cadena nucleotídica reveladora de la presencia de E. coli O157:H7.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que la secuencia de dicho ácido nucleico aislado es seleccionado del grupo que consiste en:

23. Procedimiento según la reivindicación 21 ó 22, en el que dicho ácido nucleico aislado es utilizado como cebador y/o como sonda.

24. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que dicho ácido nucleico aislado está marcado.

25. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que dicho ácido nucleico aislado está inmovilizado en un soporte.

26. Procedimiento según la reivindicación 21, que comprende las etapas siguientes:

(a)puesta en contacto de la muestra con un par de cebadores oligonucleotídicos seleccionados del grupo que consiste en:
quadcon el ácido nucleico contenido en la muestra habiendo sido, en su caso, hecho accesible para dichos cebadores en la diana buscada; (b)amplificación de la secuencia nucleotídica enmarcada por el par de cebadores elegido; (c)verificación de la presencia del producto amplificado mediante la utilización de al menos una sonda específica del producto amplificado.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, según el cual la etapa (c) comprende las subetapas siguientes:

(c1)desnaturalización de las secuencias amplificadas por un medio físico o químico; (c2)puesta en contacto con una solución que contiene los fragmentos amplificados desnaturalizados de la etapa (c1) con, por una parte, al menos una sonda de captura, y por otra parte, al menos una sonda de detección, en su caso marcada, siendo las sondas de captura y de detección susceptibles de hibridarse con la misma cadena de los fragmentos amplificados, realizándose dicha puesta en contacto durante un tiempo suficiente para permitir la reacción de hibridación; (c3)al menos un lavado para eliminar las secuencias nucleotídicas que no hayan reaccionado; (c4)revelado de las sondas de detección hibridadas para las secuencias nucleotídicas amplificadas.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que la sonda de captura se fija a la superficie de un pocillo de una placa de microvaloración.

29. Procedimiento según la reivindicación 27 ó 28, en el que la sonda de detección está marcada con peroxidasa.

30. Procedimiento según la reivindicación 29, caracterizado porque la puesta en relieve de la actividad de la peroxidasa ligada a la sonda de detección que ha reaccionado, se efectúa por reacción colorimétrica, en presencia de un sustrato cromógeno, como la tetrametilbencidina (TMB), por la puesta en práctica de las etapas siguientes:

- adición del sustrato cromógeno, como una solución de TMB en los pocillos que contienen la mezcla de reacción,

- incubación, en oscuridad, durante un tiempo suficiente para permitir el desarrollo de la coloración,

- bloqueo de la reacción por adición de una solución de parada,

- determinación de la densidad óptica para una longitud de onda apropiada.

31. Procedimiento de detección de E. coli O157:H7, según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, poniendo en práctica los oligonucleótidos siguientes:

- las secuencias SEQ ID Nº 5 e SEQ ID Nº 6, como cebadores para la amplificación,

- la secuencia SEQ ID Nº 15 como sonda de captura, y

- la secuencia SEQ ID Nº 18, como sonda de detección.

32. Equipo para la detección de las EHEC, comprendiendo entre los reactivos:

- al menos dos cebadores nucleotídicos seleccionados del grupo consistente en:

- en su caso, al menos una sonda nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:

para la detección del producto amplificado.

33. Equipo para la detección de las EHEC, según la reivindicación 32, comprendiendo:

- dos oligonucleótidos de secuencias SEQ ID Nº 21 e SEQ ID Nº 22, usados como par de cebadores,

- dos oligonucleótidos de secuencias SEQ ID Nº 25 e SEQ ID Nº 27, para la detección del producto amplificado.

34. Equipo para la detección de E. coli O157:H7, comprendiendo entre los reactivos:

- al menos dos cebadores oligonucleotídicos seleccionados del grupo consistente en:

y

- en su caso al menos un cebador oligonucleotídico seleccionado del grupo consistente en:

para la detección del producto amplificado.

35. Equipo para la detección de E. coli O157:H7 según la reivindicación 34 comprendiendo:

- dos oligonucleótidos de secuencias SEQ ID Nº 5 e SEQ ID Nº 6, usados como par de cebadores; y

- dos oligonucleótidos de secuencias SEQ ID Nº 15 e SEQ ID Nº 18 para la detección del producto amplificado.