Proceso para la detección de al menos una diana del VIH,

que comprende la etapa de producir al menos un amplicón por medio de al menos dos oligonucleótidos,

en el que dichos oligonucleótidos son cebadores que son adecuados para usar en la amplificación específica de al menos una secuencia molde de referencia seleccionada del grupo que consiste en:

- las posiciones 4281-4436 (SEC ID Nº: 2) del aislado de referencia K03455 VIH1-M; y los fragmentos de la SEC ID Nº: 2 seleccionados de las posiciones 4281-4429 (SEC ID Nº: 306), 4283-4429 (SEC ID Nº: 307), 4283-4431 (SEC ID Nº: 308) de dicho aislado VIH1-M;

- las posiciones 4336-4491 (SEC ID Nº: 4) del aislado de referencia L20587 VIH1-O, y los fragmentos de la SEC ID Nº: 4 seleccionados de las posiciones 4336-4484 (SEC ID Nº: 310), 4338-4484 (SEC ID Nº: 311) de dicho aislado VIH1-O;

- las posiciones 4889-5036 (SEC ID Nº: 5) de aislado de referencia M30502 VIH2;

- las posiciones 4176-4436 (SEC ID Nº: 1) de aislado de referencia K03455 VIH1-M y el fragmento de la SEC ID Nº: 1 que es idéntico a las posiciones 4176-4429 (SEC ID Nº: 305) de dicho aislado VIH1-M; y

- las posiciones 4231-4491 (SEC ID Nº: 3) del aislado de referencia L20587 VIH1-y el fragmento de la SEC ID Nº: 3 que es idéntico a las posiciones 4231-4484 (SEC ID Nº: 309) de dicho aislado VIH1-O;

compartiendo dichas secuencias molde de referencia la característica técnica específica de ser referencias adecuadas para construir y producir cebadores que permiten una detección múltiple cuantitativa en tiempo real de al menos uno de los subtipos del VIH1-M, VIH2-O, VIH2-A y VIH2-B;

en el que dichos cebadores son adecuados para hibridarse con dicho aislado de referencia del VIH en dichas posiciones que conducen en una secuencia aislada de referencia del VIH que consiste en dicha secuencia molde de referencia;

y opcionalmente, comprende la etapa de detectar dicho amplicón por medio de al menos una sonda

Detección del tipo y subtipo del VIH.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo del VIH y subtipos del VIH. Más precisamente, la invención se refiere a la detección de los tipos y subtipos del VIH, y especialmente a la detección múltiple de los tipos y subtipos del VIH.

Antecedentes en la técnica

El VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana) es el virus responsable del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y pertenece a la familia de retrovirus humanos. Actualmente se considera que el SIDA es una de las mayores amenazas para la salud en los seres humanos. Un individuo infectado por VIH puede transmitir la enfermedad, aunque permanezca asintomático durante años.

Varios grupos de investigación identificaron en 1983-1984, de manera independiente, el supuesto agente etiológico responsable del SIDA (véase por ejemplo Barre-Sinoussi et al., Science 220:868-871; Montagnier et al., in Human T-Cell Leukaemia Viruses (Gallo, Essex & Gross, eds.); Vilmer et al., The Lancet 1:753), y posteriormente se unificó la nomenclatura del VIH.

La familia del VIH comprende varios tipos y subtipos. Los virus VIH1 pueden clasificarse de acuerdo a subtipos. Los ejemplos de subtipos del VIH1 incluyen VIH1-M y VIH1-O. De manera similar, los virus del VIH2 incluyen diversos sub-tipos, por ejemplo VIH2-A y VIH2-B.

Para los ensayos de desarrollo de fármacos, profilaxis, así como para el tratamiento del SIDA, ha comenzado ahora a tener gran importancia el ser capaz de identificar y cuantificar de forma rápida y sencilla el grupo (o grupos), tipo (o tipos) y subtipo (o subtipos) de virus VIH presente en una muestra determinada.

En este documento, por grupo de VIH, se entiende cualquier grupo de VIH, independientemente de lo que se conoce o no en la fecha de prioridad. Se conocen en la técnica diversos grupos de VIH y se describen en la bibliografía y en las bases de datos correspondientes, por ejemplo en ncbi en Internet. Ejemplos de los mismos incluyen VIH1-M y VIH 1-O. Por subtipo de VIH, en este documento se entiende cualquier subtipo de VIH, independientemente de lo que se conoce o no en la fecha de prioridad. Se conocen en la técnica diversos subtipos de VIH y se describen en la bibliografía y bases de datos correspondientes, por ejemplo en ncbi en Internet.

Por aislado del VIH, se entiende en este documento cualquier aislado o cepa del VIH, independientemente de lo que se conoce o no en la fecha de prioridad. Se conocen diversos aislados del VIH en la técnica y se describen en la bibliografía y en la base de datos correspondiente, por ejemplo en ncbi en Internet. Algunos aislados se consideran como referencias. Ejemplos de los mismos incluyen K03455, L20587 y M30502.

Un posible enfoque podría depender del desarrollo de anticuerpos específicos. Sin embargo, en términos de sensibilidad y especificidad, un enfoque basado en PCR normalmente parece muy prometedor. Generalmente, esto también ofrece la posibilidad de trabajar sobre muestras pequeñas.

En la técnica se conocen métodos de amplificación, especialmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y métodos basados en PCR, por ejemplo PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) y PCR (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch y Sambrook, CSHL Press; Molecular Biology of the Cell, Alberts et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach y Dveksler, CSHL Press; The Polymerase Chain Reaction, Mullis, Ferre y Gibbs, Birkhauser Boston Press; Gene quantification, Ferre, Birkhauser Boston Press).

Generalmente estos métodos son herramientas muy eficaces para el análisis cualitativo y cuantitativo de muestras biológicas complejas.

Sin embargo, la eficacia de estas técnicas depende típicamente de manera crucial del diseño y de la elección de los cebadores.

Existe una técnica anterior que describe cebadores específicos del VIH1 (US 5 712 385; EP 1 043 407; WO 03/020878; EP 1 344 837). También existe una técnica anterior que describe cebadores específicos del VIH2 (US 5 962 665).

Dependiendo de las condiciones de trabajo, al menos alguno de estos cebadores de la técnica anterior puede mostrar una especificidad suficiente para VIH1 o VIH2, permitiendo de esta manera una detección específica del VIH1 y VIH2. Sin embargo, de acuerdo con el conocimiento de los solicitantes, ninguno de ellos permite:

Sin embargo, dicha detección específica múltiple cuantitativa en tiempo real sería más fiable y daría más información sobre el estado de infección actual del paciente. Esto proporcionaría por tanto tener acceso a un diagnostico más preciso, y como consecuencia, permitiría equilibrar con mayor precisión los efectos positivos frente a los negativos de un tratamiento determinado. Permitiría ajustar o elegir el tratamiento que debería ser más eficaz para el paciente particular que se diagnostica. Dicha detección específica múltiple cuantitativa en tiempo real tendría también la ventaja de ser más rápida y más fácil de ejecutar, especialmente a gran escala.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un proceso para la detección del VIH.

La presente invención proporciona oligonucleótidos, que incluyen cebadores y sondas, y conjuntos de los mismos, que son adecuados para la detección del VIH.

En este sentido, la presente invención también se refiere al campo de la amplificación, PCR y a métodos basados en PCR, así como al diagnóstico.

Por PCR o reacción PCR, se entiende en este documento cualquier método basado en PCR. Esto incluye PCR convencional, PCR cualitativa, cuantitativa y semi-cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR simple y múltiple y similares.

Por PCR en tiempo real, se entiende en este documento cualquier método basado en PCR que permite observar la fluorescencia emitida durante la reacción como un indicador de la producción del amplicón durante cada ciclo de PCR a diferencia de la detección de punto final por métodos PCR convencionales. Por PCR cuantitativa se entiende en este documento cualquier método basado en PCR que permite calcular la cantidad inicial de una determinada diana de PCR en una muestra determinada.

Por PCR múltiple, se entiende en este documento cualquier reacción de PCR que tiene por objeto la amplificación de más que una diana. Por ejemplo, la PCR múltiple incluye PCR doble (dos dianas), PCR triple (tres dianas) y PCR múltiples superiores. La PCR múltiple incluye reacciones de PCR con más de un par de cebadores, por ejemplo dos pares de cebadores. En este caso, podrían ser cuatro cebadores diferentes, pero también es posible que los dos pares de cebadores tengan un cebador en común, por ejemplo, el cebador directo y tener dos cebadores inversos distintos. La PCR múltiple también incluye reacciones PCR con un único par de cebadores, pero con más de una sonda.

Por oligonucleótido, se entiende en este documento cualquier polímero de nucleótidos corto, en el cual los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos; di desoxirribonucleótidos, nucleótidos degenerados y similares. Dichos oligonucleótidos, son preferiblemente monocatenarios. La longitud de dichos oligonucleótidos puede variar y habitualmente es menor de 150 nucleótidos (nt), preferiblemente en el intervalo de 10-100 nt, más preferiblemente 15-60 nt, incluso más preferiblemente 18-50 nt. Dichos oligonucleótidos pueden llevar modificaciones químicas, tales como etiquetado o marcaje, por ejemplo, radioactivo, fluorescente, biotinilado, o marcado con dig. De acuerdo con la invención un oligonucléotido puede ser directo (sentido) o inverso (antisentido). Además, debería destacarse que aunque puedan mencionarse funciones preferidas con respecto a algunos oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención, es obvio que un oligonucleótido determinado puede asumir varias funciones y puede usarse de diferentes maneras de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, un oligonucleótido puede usarse como un cebador, o como una sonda. También, cuando se describe que un oligonucleótido...

1. Proceso para la detección de al menos una diana del VIH,

que comprende la etapa de producir al menos un amplicón por medio de al menos dos oligonucleótidos,

en el que dichos oligonucleótidos son cebadores que son adecuados para usar en la amplificación específica de al menos una secuencia molde de referencia seleccionada del grupo que consiste en:

y opcionalmente, comprende la etapa de detectar dicho amplicón por medio de al menos una sonda.

2. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 2 o uno de dichos fragmentos de la misma y donde dicho proceso se realiza con al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

3. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:

4. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 2-3, en el que dicho proceso se realiza con al menos una sonda seleccionado del grupo que consiste en:

5. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 2-4, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:

y con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:

y, opcionalmente, con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:

6. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 4, o uno de dichos fragmentos de la misma y en el que dicho proceso se realiza con al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

7. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 6, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:

8. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 6-7, en el que dicho proceso se realiza con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:

9. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 6-8, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:

y con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:

y, opcionalmente, con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:

10. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 5 y en el que dicho proceso se realiza con al menos un oligonucléotido seleccionado del grupo que consiste en:

11. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 10, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:

12. Proceso de acuerdo una cualquiera de las Reivindicaciones 10-11, en el que dicho proceso se realiza con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:

13. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 10-12, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:

y con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:

y, opcionalmente, con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:

14. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 1 o dicho fragmento de la misma y en el que dicho proceso se realiza con al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

15. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 14, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:

16. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 14-15, en el que dicho proceso se realiza con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:

17. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 14-16, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado que es:

y con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:

y, opcionalmente, con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:

18. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 3, o dicho fragmento de la misma, y en el que dicho proceso se realiza con al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

19. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 18, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:

20. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 18-19, en el que dicho proceso se realiza con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:

21. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 18-20, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador que es:

y con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:

y, opcionalmente, con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:

22. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1-21, el que dicha etapa de producir al menos un amplicón comprende al menos una amplificación PCR simple y/o múltiple cualitativa y/o cuantitativa.

23. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1-22, en el que dichos oligonucleótidos son cebadores en bucle.

24. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1-23, en el que dichos oligonucleótidos son cebadores en bucle, que comprenden un extremo terminal 5' de 3 a 7 nucleótidos que es complementario a su extremo 3'.

25. Amplicón que puede obtenerse implementando el proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1-24 en una muestra que contiene el VIH.

26. Composición de amplificación que comprende al menos un amplicón de acuerdo con la Reivindicación 25.

27. Polinucleótido adecuado para usar como una secuencia molde de referencia en el diseño de cebadores que pueden usarse en protocolos múltiples para incluir al menos VIH1-M, VIH1-O, VIH2-A y VIH2-B en un solo proceso de amplificación ofreciendo al mismo tiempo una amplificación cuantitativa en tiempo real de la misma, seleccionándose dicho polinucleótido molde de referencia del grupo que consiste en:

- las posiciones 4281-4436 (SEC ID Nº: 2) del aislado de referencia K03455 VIH1-M; y los fragmentos de la SEC ID Nº: 2 seleccionados de las posiciones 4281-4429 (SEC ID Nº: 306), 4283-4429 (SEC ID Nº: 307), 4283- 4431 (SEC ID Nº: 308) de dicho aislado VIH1-M;

- las posiciones 4336-4491 (SEC ID Nº: 4) del aislado de referencia L20587 VIH1-O, y los fragmentos de la SEC ID Nº: 4 seleccionados de las posiciones 4336-4484 (SEC ID Nº: 310), 4338-4484 (SEC ID Nº: 311) de dicho aislado VIH1-O;

- las posiciones 4889-5036 (SEC ID Nº: 5) de aislado de referencia M30502 VIH2;

- las posiciones 4176-4436 (SEC ID Nº: 1) de aislado de referencia K03455 VIH1-M y el fragmento de la SEC ID Nº: 1 que es idéntico a las posiciones 4176-4429 (SEC ID Nº: 305) de dicho aislado VIH1-M; y

- las posiciones 4231-4491 (SEC ID Nº: 3) del aislado de referencia L20587 VIH1-y el fragmento de la SEC ID Nº: 3 que es idéntico a las posiciones 4231-4484 (SEC ID Nº: 309) de dicho aislado VIH1-O.

28. Oligonucleótido adecuado para detección del VIH, seleccionado del grupo que consiste en:

29. Oligonucleótido de acuerdo con la Reivindicación 28, seleccionado del grupo que consiste en:

30. Oligonucleótido de acuerdo con la Reivindicación 28, seleccionado del grupo que consiste en:

31. Oligonucleótido de acuerdo con la Reivindicación 28, seleccionado del grupo que consiste en:

en el que dicho oligonucleótido es adecuado para detección del VIH2-A.

32. Oligonucleótido de acuerdo con la Reivindicación 28, seleccionado del grupo que consiste en:

en el que dicho oligonucleótido es adecuado para la detección del VIH2-B.

33. Oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 28-32, en el que dicho oligonucleótido está marcado con fluorescencia.

34. Conjunto de oligonucleótidos adecuado para la detección del VIH, que comprende al menos dos oligonucleótidos seleccionados de dos grupos diferentes entre los siguientes grupos:

en el que dicho conjunto de oligonucleótidos es adecuado para detección del VIH1-M.

35. Conjunto de oligonucleótidos adecuado para la detección del VIH, que comprende:

- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 139, 148, 157,167; y/o

- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 170, 179, 189; y/o

- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 190 a 194;

en el que dicho conjunto de oligonucleótidos es adecuado para detección del VIH1-O.

36. Conjunto de oligonucleótidos adecuado para la detección del VIH, que comprende:

- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 221, 249; y/o

- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 276, 287, 296; y/o

- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 297 a 299;

en el que dicho conjunto de oligonucleótidos es adecuado para detección del VIH2-A.

37. Conjunto de oligonucleótidos adecuado para la detección del VIH, que comprende:

- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 221, 249; y/o

- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 276, 287, 296; y/o

- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 300 a 303;

en el que dicho conjunto de oligonucleótidos es adecuado para detección del VIH2-B.

38. Conjunto de oligonucleótidos adecuado para la detección del VIH, que comprende:

- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136; y/o

- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 190 a 194; y/o

- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 297 a 299; y/o

- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 300 a 303;

en el que dicho conjunto de oligonucleótidos es adecuado para detección múltiple del VIH.

39. Conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 34-38, en el que al menos uno de dichos oligonucleótidos está marcado con fluorescencia.

40. Amplicón que puede obtenerse por amplificación de una muestra que contiene el VIH con un par de cebadores seleccionados de:

- un cebador de las SEC ID Nº: 9, 12, 14 ó 15 y un cebador de las SEC ID Nº: 24, 52 ó 82; o

- un cebador de las SEC ID Nº: 148, 157 ó 167 y un cebador de las SEC ID Nº: 170, 179 ó 189; o

- un cebador de las SEC ID Nº: 221 ó 249 y un cebador de las SEC ID Nº: 276, 287 ó 296; o

- un cebador de las SEC ID Nº: 6 y un cebador de las SEC ID Nº: 24, 52 ó 82; o

- un cebador de las SEC ID Nº: 139 y un cebador de las SEC ID Nº: 170, 179 ó 189.

41. Amplicón que tiene una longitud de nucleótidos idéntica a la longitud de nucleótidos de un polinucleótido de la reivindicación 27 y que comprende una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de nucleótidos de al menos el 90% con una secuencia de sonda, a lo largo de la longitud completa de esta secuencia de sonda, en el que dicha secuencia sonda es una de las siguientes: SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136, 190, 191, 192, 193, 194, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, o una secuencia que es complementaria a una de estas secuencias de sondas SEC ID Nº: a lo largo de la longitud completa de esta secuencia SEC ID Nº: de sonda.

42. Composición de amplificación que comprende un amplicón de acuerdo con la Reivindicación 40 ó 41.

43. Kit para el diagnóstico del VIH, que comprende:

a) al menos un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 28-33; y/o

b) al menos un conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 34-39; y

c) opcionalmente, instrucciones para su uso.