NUEVOS COLORANTES FLUORESCENTES QUE SE UNEN AL ADN DE DOBLE CADENA.

Colorante fluorescente que tiene la fórmula caracterizado porque 5  - cualquiera de A1,

A2, A3 y A4 son H o uno de A1, A2, A3 y A4 es un sustituyente que es un halogenilo y los otros son H - B es seleccionado entre el grupo que consiste en S, O, N-R, y C-(R)2 en el que R es C1-C6-Alquilo 10  - D es C1-C6-alquilo sustituido o no sustituido - X es H o un grupo metoxi - Y es seleccionado entre el grupo que consiste en S, O, N-R en el que R es C1-C6-Alquilo, y Z1-C=C-Z2, en el que Z1 y Z2 independientemente entre si son H o un grupo metoxi 15  - L es CH3 o fenilo - M es fenilo o un C1-C18 amino-alquilo sustituido o no sustituido. en el que

Nuevos colorantes fluorescentes que se unen al ADN de

doble cadena Descripción La presente invención se refiere a una nueva clase de

colorantes fluorescentes que son capaces de emitir fluorescencia en el caso de que sean debidamente excitados en la situación de encontrarse específicamente unidos a un ácido nucleico de doble cadena o dsADN. Estos colorantes que se unen a dsADN son utilizados frecuentemente para controlar la amplificación del ácido nucleico en tiempo real o para llevar a cabo análisis de curvas de fusión de ADN con dependencia de la temperatura.

Técnicas anteriores

Los colorantes fluorescentes que se unen a ADN de doble cadena, tal como bromuro de etidiuino, han sido utilizados durante largo tiempo para el marcado de ácidos

fluorescentes que se unen a ADN de doble cadena han sido utilizados en la técnica para control en tiempo real de la amplificación de ácidos nucleicos, tales como PCR, o análisis de curva de fusión. El correspondiente producto de amplificación es detectado por un colorante fluorescente que se une a ADN, que emite una correspondiente señal de fluorescencia cuando tiene lugar la interacción con el ácido nucleico de doble cadena después de excitación con

una luz que tiene la longitud de onda apropiada. Se ha demostrado que es adecuado para esta aplicación el colorante que se intercala por lo menos parcialmente SybrGreenI (sondas moleculares).

Debido al hecho de que la detección de amplificación en tiempo real con este formato no puede discriminar entre productos específicos y artefactos de amplificación, tales como cebador/dímeros, se lleva a cabo habitualmente un análisis subsiguiente de curva de fusión. Después de completar la reacción PCR, se incrementa la temperatura de la muestra y se detecta la fluorescencia siempre que el SybrGreen se haya unido al ADN de doble cadena presente en las muestras. Después de la disociación del ADN de doble cadena la señal disminuye inmediatamente. Esta disminución es controlada con un fluorescente apropiado con respecto a un gráfico tiempo-temperatura, de manera tal que se puede determinar un primer valor derivado para el que se observa la máxima disminución de fluorescencia. Dado que los ADN de

Se conocen en la técnica varios colorantes fluorescentes que se unen a ADN de doble cadena, que pueden ser utilizados como agente de detección para PCR en tiempo real y análisis de curvas de fusión. El ejemplo más notable y utilizado más frecuentemente es SybrGreen I, que es un colorante de cianina monómero asimétrico que comprende un

sistema de anillo de benzotiazolio N-alquilado que está

enlazado con intermedio de un puente de monometina a un anillo de piridinio o de quinolinio (US 5.658.751). De manera más precisa, SybrGreen tiene la fórmula química [2[N-(-3-dimetilaminopropil)-N-propilamino]-4-[2,3-dihidro-3metil-(benzo-1,3-tiazol-2-il)-metilideno]-1-fenilquinolinio]+ (Zipper, H., y otros, Nucl. Acids Res. 32 (2004) e103). En el colorante relacionado PicoGreen, la fórmula química es [2-[N-bis-(-3-dimetilaminopropil)amino]-4-[2,3-dihidro-3-metil-(benzo-1,3-tiazol-2-il)metilidenol-1-fenil-quinolinio]+.

El documento 4.937.198 da a conocer un colorante relacionado fluorescente que se une a ADN, que tiene la fórmula química 3-metil-2-[[(3,7-dimetil-6-purinilideno)metil]-benzotiazolio, que ha sido utilizado satisfactoriamente para el marcado de ácido nucleico en ensayos basados en células. Otros colorantes y respectivos medios analíticos se dan a conocer en el documento de Moreda, W. y Forrester, A.R., Tetrahedron 53 (1997) 1259512604.

El documento WO 04/38038 da a conocer ejemplos de colorantes fluorescentes que se unen a dsADN que se basan en un sistema de anillo de pirimidinio y benzotiazolio que están conectados a un puente de metina. En contraste con SybrGreen, es posible utilizar estos colorantes para detectar productos de amplificación PCR en condiciones de saturación, es decir, elevadas concentraciones en las que cada molécula de ADN se une ya con un número máximo de moléculas de fluorescente. Dentro del documento US

2005/233335, el mismo grupo de inventores da a conocer

otros ejemplos específicos de moléculas fluorescentes que comprenden una fracción de pirimidina y una fracción de benzotiazolio.

Muchos de los colorantes que se han dado a conocer han sido utilizados satisfactoriamente para PCR en tiempo real y análisis de amplificación de curvas de fusión. No obstante, todos los colorantes fluorescentes que se unen a ADN de doble cadena descritos en la técnica tienen o bien una estabilidad limitada y/o tienen utilizaciones solamente limitadas para métodos mejorados de análisis de curva de fusión. Para estos métodos mejorados de análisis de curva de fusión, que se pueden aplicar para escaneado de mutación

De este modo ha sido un objeto de la presente invención dar a conocer un colorante fluorescente que se une a ADN de doble cadena, mejorado, que aumenta la estabilidad y mejora el rendimiento durante el análisis de la curva de fusión de ADN.

Breve descripción de la invención

En un primer aspecto, la presente invención está dirigida a un colorante fluorescente que comprende una fracción de benzotiazolio y una fracción de pirimidinio conectadas por un puente mono-metina, caracterizado porque:

(i) la posición 2 de la pirimidina lleva un sustituyente que empieza con un átomo de C; y

(ii) las posiciones 5 y 6 del anillo de pirimidina son parte integral de otra estructura de anillo aromático. De manera más precisa, en un primer aspecto la presente invención está dirigida a un colorante fluorescente que tiene la fórmula:

**(Ver fórmula)**

5 caracterizado porque:

- cualquiera de A1, A2, A3 y A4 son H o uno de A1, A2, A3 y A4 es un sustituyente que es preferentemente un halogenilo, y los otros son H

- B se selecciona del grupo que consiste en S, O, N-R, 10 y C-(R)2 en el que R es C1-C6-Alquilo

- D es un C1-C6 alquilo sustituido o no sustituido

- X es H o un grupo metoxi

- Y se selecciona del grupo que consiste en S, O, N-R

en el que R es C1-C6-Alquilo, y Z1-C=C-Z2, en el que Z1 y Z2 15 independientemente uno de otro son H o un grupo metoxi

- L es CH3 o fenilo

- M es fenilo o un C1-C18 amino-alquilo sustituido o no sustituido. En una realización, D es -(CH2)n-COOH ó -(CH2)n-CO20 Osuccininimidaa, caracterizado porque n es un número entero comprendido entre 1 y 6.

De manera ventajosa, M es -(CH2)n -N+-(CH3)3, en el que n es un número entero comprendido entre 1 y 18.

En un segundo aspecto, la presente invención está dirigida a un procedimiento para la preparación de un colorante fluorescente de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas:

5 a) disponer una sustancia química que tiene la fórmula:

**(Ver fórmula)**

caracterizada porque

- X es H o un grupo metoxi -Y es seleccionado entre el grupo que consiste en S, O, N-R, en el que R es C1-C6-Alquilo, y Z1-C=C-Z2, en el que Z1 y Z2 son independientemente uno de otro H o un grupo metoxi

- L es CH3 o fenilo

15 b) hacer reaccionar dicha sustancia con un cloruro ácido sustituido a efectos de generar un derivado de 1,4- dihidropirimidin-4-ona

c) hacer reacción dicho derivado de 1,4dihidropirimidin-4-ona con un reactivo de tionación para 20 generar un derivado de 1,4-dihidropirimidin-tiona

d) hacer reacción dicho derivado de 1,4dihidropirimidin-tiona con yodometano para generar un derivado de 4-metiltio-pirimidina

e) hacer reaccionar dicha 4-metiltio-pirimidina con un 25 compuesto de fórmula:

**(Ver fórmula)**

caracterizado porque:

- cualquiera de A1, A2, A3 y A4 son H o uno de A1, A2, A3 y A4 es un sustituyente que...

1. Colorante fluorescente que tiene la fórmula

**(Ver fórmula)**

caracterizado porque

5 - cualquiera de A1, A2, A3 y A4 son H o uno de A1, A2, A3 y A4 es un sustituyente que es un halogenilo y los otros son H

- B es seleccionado entre el grupo que consiste en S,

O, N-R, y C-(R)2 en el que R es C1-C6-Alquilo 10 - D es C1-C6-alquilo sustituido o no sustituido

- X es H o un grupo metoxi

- Y es seleccionado entre el grupo que consiste en S, O, N-R en el que R es C1-C6-Alquilo, y Z1-C=C-Z2, en el que Z1 y Z2 independientemente entre si son H o un grupo metoxi

15 - L es CH3 o fenilo

- M es fenilo o un C1-C18 amino-alquilo sustituido o no sustituido.

2. Colorante fluorescente, según la reivindicación 1, en el que -D es-(CH2)n-COOH o bien -(CH2)n-CO-OSuccininimida, carcaterizado porque n es un número entero comprendido entre 1 y 6.

3. Colorante fluorescente, según las reivindicaciones 1-2, en el que

- M es -(CH2)n -N+-(CH3)3, en el que n es un número natural comprendido entre 1 y 18. 4. Método para preparar un colorante fluoresecente, según la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas

a) disponer una sustancia química con la fórmula

**(Ver fórmula)**

10 Caracterizada porque

- X es H o un grupo metoxi

- Y es seleccionado entre el grupo que consiste en S, O, N-R, en el que R es C1-C6-Alquilo, y Z1-C=C-Z2, en el que Z1 y Z2 independientemente entre si son H o un grupo metoxi

15 - L es CH3 o fenilo

b) hacer reaccionar dicha sustancia con un cloruro ácido sustituido a efectos de generar un derivado de 1,4-Dihidropirimidin-4-ona

20 c) hacer reaccionar dicho derivado de 1,4-Dihidropirimidin-4-ona con un agente de tionación a efectos de generar un derivado de 1,4- Dihidropirimidin-4-tiona

d) hacer reaccionar dicho derivado de 1,4-Dihidropirimidin-4-tiona con yodometano a efectos de 25 generar un derivado de 4-Metiltio-pirimidina

e) hacer reaccionar dicha 4-Metiltio-pirimidina con un compuesto que tiene la fórmula

**(Ver fórmula)**

caracterizado porque

- o bien la totalidad de A1, A2, A3 y A4 son H o uno de A1, A2, A3 y A4 es un sustituyente que preferentemente es un Halogenilo y los otros son H

- B es seleccionado del grupo que consiste en S, O, NR, y C-(R )2 en el que R es C1-C6-Alquilo

- D es un C1-C6 Alquilo sustituido o no sustituido.

5. Utilización de un compuesto, según las reivindicaciones 1-3, para la detección de ácidos nucleicos de doble cadena.

6. Utilización, según la reivindicación 5, en el que la detección es llevada a cabo durante un análisis de curva de fusión.

7. Utilización, según la reivindicación 5, en la que la detección es llevada a cabo durante una reacción de amplificación de ácido nucleico en tiempo real.

8. Utilización, según la reivindicación 5, en la que la detección es llevada a cabo con una matriz de gel.

9. Mezcla de reacción que comprende, como mínimo

- un compuesto, según las reivindicaciones 1-3

- una ADN polimerasa termoestable

- una mezcla de trifosfatos de desoxinucleósidos, y

- un tampón.