Análisis de fusión de amplicones con colorantes de saturación.

Procedimiento de análisis por PCR que comprende las etapas de:

proporcionar una mezcla de un colorante de unión a ADNbc y cebadores configurados para amplificar el ácidonucleico diana,

amplificar el ácido nucleico diana en presencia del colorante de unión a ADNbc,

monitorizar la fluorescencia del colorante de unión a ADNbc,

generar una curva de fusión para el ácido nucleico diana,

normalizar las diferencias de magnitud de la curva de fusión,

repetir las etapas de provisión, amplificación, normalización y generación con, como mínimo, un ácido nucleico dianaadicional,

representar gráficamente una diferencia de fluorescencia entre las curvas de fusión normalizadas, en el que la curvade fusión normalizada de un ácido nucleico diana se selecciona como patrón y se representa gráficamente comopatrón en temperaturas y las curvas de fusión normalizadas para ácido nucleico diana adicional se representagráficamente como una diferencia con las temperaturas en el patrón;

y utilizar la diferencia representada gráficamente entre las curvas de fusión normalizadas para identificar genotiposde los ácidos nucleicos diana.

Análisis de fusión de amplicones con colorantes de saturación SECTOR DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos para realizar análisis de ácido nucleico en presencia de un colorante de unión a ácido nucleico bicatenario.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los procedimientos para analizar la variación de la secuencia de ADN pueden dividirse en dos categorías generales: 1) determinación del genotipo para variantes de secuencia conocidas y 2) rastreo en busca de variantes desconocidas. Existen muchos procedimientos para determinar el genotipo de variantes de secuencia conocidas, y están disponibles procedimientos en tubo cerrado homogéneos de etapa única que utilizan sondas fluorescentes (Lay MJ, y otros, Clin. Chem 1997; 43: 2262-7) . En contraste, la mayoría de las técnicas de rastreo en busca de variantes desconocidas requieren electroforesis en gel o separación en columna después de la PCR. Éstas incluyen polimorfismo de conformación monocatenaria (Orita O, y otros, Proc Natl Acad Sci, Estados Unidos 1989; 86: 2766-70) , migración de heterodúplex (Nataraj AJ, y otros, Electrophoresis 1999; 20: 1177-85) , electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (Abrams ES, y otros, Genomics 1990; 7: 463-75) , electroforesis en gel con gradiente de temperatura (Wartell RM, y otros, J Chromatogr A 1998; 806: 169-85) , procedimientos de escisión enzimática o química (Taylor GR, y otros, Genet Anal 1999; 14: 181-6) , así como secuenciación de ADN. La identificación de nuevas mutaciones por secuenciación también requiere múltiples etapas después de la PCR, concretamente secuenciación cíclica y electroforesis en gel. La cromatografía de líquidos de alta resolución desnaturalizante (Xiao W, y otros, Hum Mutat 2001; 17: 439-74) implica inyectar el producto de PCR en una columna.

Recientemente, se han descrito procedimientos fluorescentes homogéneos para rastreo de mutaciones. SYBR® Green I (Molecular Probes, Eugene, Oregón) es un colorante de ADN, específico de cadena doble utilizado a menudo para monitorizar la formación de producto (Wittwer CT, y otros, BioTechniques 1997; 22: 130-8) y la temperatura de fusión (Ririe KM, y otros, Anal. Biochem 1997; 245: 154-60) en PCR en tiempo real. La presencia de cambios heterocigóticos de una única base se ha detectado en productos de hasta 167 pb mediante análisis de la curva de fusión con SYBR® Green I (Lipsky RH, y otros, Clin Chem 2001; 47: 635-44) . Sin embargo, posteriormente a la amplificación y antes del análisis de la fusión, el producto de PCR se purificó y se añadieron altas concentraciones de SYBR® Green I. La concentración de SYBR® Green I utilizada para la detección en este procedimiento inhibe la PCR (Wittwer CT, y otros BioTechniques 1997; 22: 130-1, 134-8) ; por lo tanto, el colorante se añadió después de la amplificación. Un colorante que pudiera utilizarse para detectar la presencia de cambios de una sola base heterocigóticos y pudiera añadirse antes de la PCR sería deseable.

Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son, de lejos, las variaciones genéticas más habituales observadas en el ser humano y otras especies. En estos polimorfismos, solamente una única base varía entre individuos. La alteración puede causar un cambio de aminoácidos en una proteína, alterar las velocidades de transcripción, afectar al corte y empalme de ARNm o no tener ningún efecto evidente sobre los procesos celulares. Algunas veces, cuando el cambio es silencioso (por ejemplo, cuando el aminoácido que codifica no cambia) , la determinación del genotipo de SNP puede seguir siendo valiosa si la alteración está unida a (asociada con) un único fenotipo causado por otra alteración genética.

Existen muchos procedimientos para determinar el genotipo del SNP. La mayoría utilizan PCR u otras técnicas de amplificación para amplificar la plantilla de interés. Pueden emplearse técnicas analíticas contemporáneas o posteriores, incluyendo electroforesis en gel, espectrometría de masas y fluorescencia. Las técnicas de fluorescencia que son homogéneas y no requieren la adición de reactivos después del comienzo de la amplificación o el muestreo físico de las reacciones para análisis son atractivas. Las técnicas homogéneas ejemplares utilizan cebadores de oligonucleótidos para localizar la región de interés y marcas o colorantes fluorescentes para la generación de señales. Los procedimientos basados en PCR ilustrativos son completamente en tubo cerrado, utilizando una enzima termoestable que es estable a la temperatura de desnaturalización del ADN, de modo que después de que haya comenzado el calentamiento, no son necesarias adiciones.

Varios procedimientos de PCR fluorescentes, homogéneos, en tubo cerrado están disponibles para determinar el genotipo del SNP. Estos incluyen sistemas que utilizan sondas de oligonucleótidos FRET con dos cromosomas que interactúan (sondas de hibridación adyacentes, sondas TaqMan, Molecular Beacons (balizas moleculares) , sondas Scorpion) , sondas de un único oligonucleótido con solamente un fluoróforo (sondas G-quenching, Crockett, A.O. y

C. T. Wittwer, Anal. Biochem. 2001; 290: 89-97 y SimpleProbes, Idaho Technology) , y técnicas que utilizan un colorante de ADNbc (ADN bicatenario) en lugar de sondas de oligonucleótidos covalentes marcadas de forma fluorescente. Las técnicas con colorantes son atractivas dado que no se requieren sondas de oligonucleótidos marcadas, permitiendo un tiempo de diseño y un coste reducidos de los ensayos.

Se han publicado dos técnicas para determinar el genotipo de SNP utilizando colorantes de ADNbc. La amplificación específica de alelos en presencia de colorantes de ADNbc también puede utilizarse para determinar el genotipo con PCR en tiempo real (Germer S, y otros, Genome Research 2000; 10: 258-266) . En el procedimiento de la referencia de Germer, dos cebadores específicos de alelos difieren en su base 3' y amplifican de forma diferencial uno o el otro alelo en presencia de un cebador inverso común. Aunque no se necesitan oligonucleótidos marcados fluorescentemente, la determinación del genotipo requiere tres cebadores y dos pocillos para cada genotipo de SNP. Además, es necesario un instrumento de PCR en tiempo real que monitorice la fluorescencia cada ciclo.

El otro procedimiento a base de colorantes no requiere monitorización en tiempo real, necesita solamente un pocillo por genotipo de SNP, y utiliza análisis de fusión (Germer, S, y otros, Genome Research 1999; 9: 72-79) . En este procedimiento, también se utiliza amplificación específica de alelos, requiriendo tres cebadores, como con el procedimiento de Germer previo. Además, uno de los cebadores incluye una cola de pinza GC para elevar la temperatura de fusión de un amplicón, permitiendo la diferenciación por temperatura de fusión en un pocillo. La fluorescencia se monitoriza después de la amplificación por PCR, y no se requiere la adquisición en tiempo real.

El documento US6346386 (Elenitoba-Johnson) describe un procedimiento adicional para analizar alteraciones del ADN utilizando un colorante de unión a ADN bicatenario y perfiles de fusión de fluorescencia.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención da a conocer un procedimiento de análisis de ADN, según la reivindicación 1.

Para los fines de la presente invención, un colorante “de saturación” es un colorante que no inhibe significativamente la PCR cuando está presente a concentraciones que proporcionan una señal de fluorescencia máxima para una cantidad de ADNbc generada habitualmente por PCR en ausencia de colorante, de forma ilustrativa aproximadamente 10 ng/μl. Aunque los colorantes se identifican por su compatibilidad con PCR a concentraciones cercanas a la saturación, se entiende que los colorantes pueden utilizarse a concentraciones mucho más bajas. Durante o posteriormente a la amplificación, los colorantes pueden utilizarse para distinguir heterodúplex y homodúplex mediante análisis de la curva de fusión de manera similar a cuando se utilizan cebadores marcados. La identificación de heterodúplex y homodúplex puede utilizarse para diversos análisis, incluyendo rastreo de mutaciones y determinación del genotipo de SNP. El término “rastreo” se refiere al proceso en el que un fragmento de ácido nucleico se compara con un fragmento de ácido nucleico de referencia para detectar la presencia de cualquier diferencia en la secuencia. Una respuesta positiva que indica la presencia de una diferencia de secuencia puede no reflejar necesariamente la naturaleza exacta de la diferencia de secuencia o su posición en el fragmento de ácido nucleico. La expresión “determinación del genotipo”... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de análisis por PCR que comprende las etapas de:

proporcionar una mezcla de un colorante de unión a ADNbc y cebadores configurados para amplificar el ácido nucleico diana, amplificar el ácido nucleico diana en presencia del colorante de unión a ADNbc, monitorizar la fluorescencia del colorante de unión a ADNbc, generar una curva de fusión para el ácido nucleico diana, normalizar las diferencias de magnitud de la curva de fusión, repetir las etapas de provisión, amplificación, normalización y generación con, como mínimo, un ácido nucleico diana adicional, representar gráficamente una diferencia de fluorescencia entre las curvas de fusión normalizadas, en el que la curva de fusión normalizada de un ácido nucleico diana se selecciona como patrón y se representa gráficamente como patrón en temperaturas y las curvas de fusión normalizadas para ácido nucleico diana adicional se representa gráficamente como una diferencia con las temperaturas en el patrón; y utilizar la diferencia representada gráficamente entre las curvas de fusión normalizadas para identificar genotipos de los ácidos nucleicos diana.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende, además, la etapa de desplazar la temperatura de las curvas de fusión superponiendo una parte de cada curva.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el colorante de unión a ADNbc tiene un porcentaje de saturación de, como mínimo, el 90% y se selecciona entre LC Green, PO-PRO™-1, SYTO®45, POPO™-3, SYTOX® Blue y SYTO®43 y que comprende identificar el genotipo utilizando una forma de la curva de fusión.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que el ácido nucleico diana es un locus de un gen de HLA de un primer individuo y el segundo ácido nucleico es el mismo locus de un gen de HLA de un segundo individuo.

5. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que la etapa de monitorización se realiza utilizando un fluorímetro que tiene un intervalo de excitación d.

45. 490 nm y un intervalo de detección de emisión d.

51. 530 nm, y el colorante tiene un máximo de excitación en un intervalo d.

41. 465 nm y un máximo de emisión en un intervalo d.

45. 500 nm.

6. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que la muestra comprende, además, una sonda configurada para hibridar con el ácido nucleico diana, dicha sonda marcada con un colorante aceptor para aceptar transferencia de energía por resonancia de fluorescencia del colorante de unión a ADNbc, y que comprende, además, la etapa de monitorizar la fluorescencia del colorante aceptor.

7. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que la etapa de monitorización comprende, además, utilizar la curva de fusión para determinar si el ácido nucleico diana tiene la misma secuencia que un segundo ácido nucleico.