NUEVO METODO DE CLONACION DE DNA BASADO EN EL SISTEMA DE RECOMBINACION RECE-RECT DE E. COLI.

Un método para la clonación de moléculas de DNA en células, que comprende los pasos de

(a) proporcionar una célula huésped aislada capaz de realizar la recombinación homóloga mediante un mecanismo dependiente de recET,

(b) poner en contacto en la mencionada célula huésped una primera molécula de DNA circular, capaz de ser replicada en la mencionada célula huésped, con una segunda molécula de DNA que comprende al menos dos regiones de homología de secuencia para regiones de la primera molécula de DNA, en condiciones que favorecen la recombinación homóloga entre las mencionadas moléculas primera y segunda de DNA mediante un mecanismo dependiente de recET y

(c) seleccionar una célula huésped aislada en la que ha ocurrido la recombinación homóloga entre las mencionadas moléculas primera y segunda de DNA,

en el cual una segunda molécula de DNA se introduce en la célula huésped de una forma que permite la recombinación sin modificación ulterior, con la condición de que la célula huésped no sea una célula madre embrionaria humana o una célula de una línea germinal humana

Nuevo método de clonación de DNA basado en el sistema de recombinación recE-recT de E. coli.

La invención hace referencia a un nuevo método para la clonación de moléculas de DNA utilizando un mecanismo de recombinación homóloga entre al menos dos moléculas de DNA. Además, se proporcionan nuevos estuches de reactivos adecuados para la clonación de DNA.

Los métodos actuales para clonación de DNA extraño en células bacterianas comprenden usualmente los pasos de proporcionar un vector bacteriano adecuado, escindir dicho vector con una enzima de restricción e insertar in vitro un fragmento de DNA extraño en dicho vector. Los vectores recombinantes resultantes se utilizan luego para transformar bacterias. Aunque tales métodos de clonación se han utilizado satisfactoriamente desde hace aproximadamente 20 años, presentan varios inconvenientes. Estos inconvenientes son, en particular, que los pasos in vitro requeridos para insertar DNA extraño en un vector son a menudo muy complicados y requieren mucho tiempo, si no están disponibles sitios de restricción adecuados en el DNA extraño o el vector.

Adicionalmente, los métodos actuales están basados usualmente en la presencia de sitios de escisión por enzimas de restricción adecuadas en el vector en el cual se inserta el fragmento de DNA extraño. Esto impone dos limitaciones en el producto de clonación final. En primer lugar, el fragmento de DNA extraño puede insertarse usualmente sólo en el vector en la posición de un sitio o sitios de restricción de este tipo. Así, el producto de clonación está limitado por la disposición de sitios de restricción adecuados y la clonación en regiones del vector en las cuales no existe un sitio de restricción adecuado es difícil y a menudo imprecisa. En segundo lugar, dado que los sitios de restricción tienen típicamente una longitud de 4 a 8 pares de bases, los mismos se presentan un número múltiple de veces a medida que aumenta el tamaño de las moléculas de DNA que se utilizan. Esto representa una limitación práctica para el tamaño de las moléculas de DNA que pueden manipularse por la mayoría de las técnicas de clonación actuales. En particular, los tamaños mayores de DNA clonados en vectores tales como cósmidos, BACs, PACs y P1s son tales que usualmente es imposible en la práctica manipularlos directamente por técnicas basadas en enzimas de restricción. Por esta razón, existe necesidad de proporcionar un nuevo método de clonación, del cual se hayan eliminado al menos en parte los inconvenientes de la técnica anterior.

De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que un mecanismo de recombinación homóloga eficiente entre dos moléculas de DNA tiene lugar a frecuencias utilizables en una célula huésped bacteriana que es capaz de expresar los productos de los genes recE y recT o genes funcionalmente afines tales como los genes reda y redß, o el sistema de recombinación del fago P22 (Kolod-ner et al., Mol. Microbiol. 11 (1994) 23-30; Fenton, A.C. y Poteete, A.R., Virology 34 (1984) 148-160; Poteete, A.R. y Fenton, A.C., Virology 134 (1984) 161-167. Este nuevo método de clonación de fragmentos de DNA se denomina "clonación ET".

La identificación y caracterización de las proteínas RecE y RecT de E. coli ha sido descrita por Gillen et al. (J. Bacteriol. 145 (1981), 521-532) y Hall et al. (J. Bacteriol. 175 (1993), 277-287). Hall y Kolodner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 3205-3209) describen el apareamiento homólogo in vitro y el intercambio de cadenas de DNA bicatenario lineal y DNA monocatenario circular homólogo promovidos por la proteína RecT. En dichos lugares no puede encontrarse referencia alguna al uso de este método para la clonación de moléculas de DNA en células.

El camino recET de recombinación genética en E. coli es conocido (Hall y Kolodner (1994), supra; Gillen et al. (1981), supra). Este camino requiere la expresión de dos genes, recE y recT. La secuencia de DNA de estos genes ha sido publicada (Hall et al., supra). La proteína RecE es similar a proteínas de bacteriófago, tales como ? exo o ? Reda (Gillen et al., J. Mol. Biol. 113 (1977), 27-41; Little, J. Biol. Chem. 242 (1967), 679-686; Radding y Carter, J. Biol. Chem. 246 (1971), 2513-2518; Joseph y Kolodner, J. Biol. Chem. 258 (1983), 10418-10424. La proteína RecT es similar a proteínas de bacteriófago, tales como ? ß-proteína o ? Recß (Hall et al. (1993), supra; Muniyappa y Radding, J. Biol. Chem. 261 (1996), 7472-7478; Kmiec y Hollomon, J. Biol. Chem. 256 (1981), 12636-12639). El contenido de los documentos citados anteriormente se incorpora en esta memoria por referencia.

Oliner et al. (Nucl. Acids Res. 21 (1993), 5192-5197 describen la clonación in vivo de productos PCR en E. coli por recombinación homóloga intermolecular entre un producto lineal de PCR y un vector de plásmido linealizado. Otros intentos previos para desarrollar nuevos métodos de clonación basados en recombinación homóloga en procariotas, asimismo, se basaban en el uso de enzimas de restricción para linealizar el vector (Bubeck et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 3601-3602; Oliner et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993), 5192-5197; Degryse, Gene 170 (1996), 45-50) o en el sistema de recombinación dependiente de recA específico del huésped (Hamilton et al., J. Bacteriol. 171 (1989), 4617-4622; Yang et al., Nature Biotech. 15 (1997), 859-865; Dabert y Smith, Genetics 145 (1997), 877-889). Estos métodos son de aplicabilidad muy limitada y se utilizan escasamente en la práctica.

El nuevo método de clonación de DNA de acuerdo con la presente invención no requiere tratamientos in vitro con enzimas de restricción o DNA-ligasas, y por consiguiente es fundamentalmente distinto de las metodologías estándar de clonación de DNA. El método está basado en un camino de recombinación homóloga en E. coli que implica los productos de los genes recE y recT, o los productos de los genes reda y redß, o productos de genes funcionalmente equivalentes. El método combina covalentemente un fragmento de DNA preferiblemente lineal y preferiblemente extracromosómico, el fragmento de DNA a clonar, con una segunda molécula vectora de DNA preferiblemente circular, sea un episoma o el cromosoma o cromosomas endógeno(s) del huésped. Por consiguiente, dicho método es distinto de las descripciones previas de clonación en E. coli por recombinación homóloga que están basadas en el uso de dos fragmentos de DNA lineales o caminos de recombinación diferentes.

La presente invención proporciona un camino flexible para utilizar recombinación homóloga a fin de diseñar grandes moléculas de DNA que incluyen un plásmido intacto >76 kb y el cromosoma de E. coli. Así, prácticamente no hay limitación alguna de elección de la diana, de acuerdo con el tamaño o el sitio. Por consiguiente, cualquier DNA receptor en una célula huésped, desde un plásmido de copias altas al genoma, es susceptible de alteración precisa. Además del diseño por ingeniería genética de grandes moléculas de DNA, la invención reseña nuevos métodos independientes de las enzimas de restricción para el diseño de DNA. Por ejemplo, deleciones entre dos pares de bases seleccionados cualesquiera en un episoma diana pueden realizarse por elección de ramas de homología de oligonucleótidos. Análogamente, pueden insertarse secuencias de DNA seleccionadas en un par de bases seleccionado para crear, por ejemplo, marcos de lectura de proteínas alterados. Combinaciones concertadas de inserciones y deleciones, así como mutaciones puntuales, son también posibles. La aplicación de estas estrategias es particularmente relevante para construcciones de DNA complejas o difíciles, por ejemplo, las propuestas para recombinaciones homólogas en células eucariotas, v. g. células madre de embrión de ratón. Adicionalmente, la presente invención proporciona un camino simple para posicionar sitios diana de recombinación específica de sitio exactamente donde se desee. Esto simplificará las aplicaciones de recombinación específica de sitio en otros sistemas vivos, tales como plantas y ratones.

Una materia objeto de la presente invención es un método para la clonación de moléculas de DNA en células procariotas que comprende los pasos de: