NUEVO BIOSENSOR AMPEROMETRICO, PROCEDIMIENTO DE FABRICACION Y USOS.

Nuevo biosensor amperométrico, procedimiento de fabricación y usos.

Se basa en la combinación de la enzima Lacasa y materiales Sonogel-Carbono.

Es aplicable a medidas in situ de analitos de interés en muestras agroalimentarias durante los procesos de fabricación, embalaje, y/o almacenamiento. Además, dada la gran selectividad debida a la presencia de la sustancias biológica, es posible adaptar el mismo diseño para una amplia gama de muestras de interés en un campo tan importante como es el medioambiental

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200702447.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE CADIZ.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: CÁDIZ.

Inventor/es: HIDALGO HIDALGO DE CISNEROS,JOSE LUIS, NARANJO RODRIGUEZ,IGNACIO, EL KAOUIT,MOHAMMED.

Fecha de Solicitud: 14 de Septiembre de 2007.

Fecha de Publicación: 8 de Febrero de 2010.

Fecha de Concesión: 26 de Enero de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

C12N11/04 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 11/00 Enzimas fijadas sobre un soporte o inmovilizadas; Células microbianas fijadas sobre un soporte o inmovilizadas; Su preparación. › atrapadas en el interior del soporte, p. ej. en un gel o en fibras huecas.
C12N11/08 C12N 11/00 […] › siendo el soporte un polímero sintético.
C12Q1/26 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una oxidorreductasa.
G01N33/02 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › alimentación.
G01N33/14 G01N 33/00 […] › bebidas.
G01N33/18D
G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
H01M8/16 ELECTRICIDAD. › H01 ELEMENTOS ELECTRICOS BASICOS. › H01M PROCEDIMIENTOS O MEDIOS, p. ej. BATERÍAS, PARA LA CONVERSION DIRECTA DE LA ENERGIA QUIMICA EN ENERGIA ELECTRICA. › H01M 8/00 Pilas de combustible; Su fabricación. › Pilas de combustible bioquímicas, es decir, pilas en las que los microorganismos actúan como catalizadores.

Clasificación PCT:

C12N11/04 C12N 11/00 […] › atrapadas en el interior del soporte, p. ej. en un gel o en fibras huecas.
C12N11/08 C12N 11/00 […] › siendo el soporte un polímero sintético.
C12Q1/26 C12Q 1/00 […] › en los que interviene una oxidorreductasa.
G01N33/02 G01N 33/00 […] › alimentación.
G01N33/14 G01N 33/00 […] › bebidas.
G01N33/18 G01N 33/00 […] › agua.
G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
H01M8/16 H01M 8/00 […] › Pilas de combustible bioquímicas, es decir, pilas en las que los microorganismos actúan como catalizadores.

Fragmento de la descripción:

Nuevo biosensor amperométrico, procedimiento de fabricación y usos.

Sector de la técnica

La presente invención describe:

1-Un método nuevo de fabricación de biosensores amperométricos basados en el material Sonogel-Carbono y la enzima Lacasa. 2-El uso de esos biosensores para la determinación cualitativa y cuantitativa de polifenoles en cerveza, en otras bebidas y en extractos vegetales en general.

Estado anterior a la técnica

Un biosensor amperométrico puede ser definido como un dispositivo de medida que contiene una sustancia biológica íntimamente conectada o integrada a un transductor: un electrodo amperométrico en este caso. (IUPAC, 1996).

La novedad del biosensor que se propone se puede encontrar en dos aspectos principales.

Primero, el uso por primera vez en la historia de nuestro electrodo Sonogel- Carbono como parte transductora de un biosensor a base de la enzima Lacasa. En este punto queremos subrayar que el material Sonogel-Carbono es un compuesto totalmente diferente de los electrodos cerámicos Sol-gel carbono.

Segundo, el desarrollo de un nuevo método bio-electroquímico basado sobre la enzima Lacasa como elemento de reconocimiento biológico para medir polifenoles en muestras de cerveza, así como en otras bebidas y extractos vegetales.

Según la definición de la IUPAC, antes citada, el esquema general de un biosensor está constituido por tres partes principales: el transductor, el elemento de reconocimiento biológico y la matriz de inmovilización. La siguiente invención comunica novedades en los tres componentes de este esquema.

En primer lugar se comunica por primera vez la posibilidad del uso de nuestro material Sonogel-Carbono como transductor electroquímico (electrodo) en un biosensor a base de la enzima lacasa. Este electrodo demostró ventajas sobre otros electrodos similares cuando es usado como sensor electroquímico o como base de un biosensor a base de la enzima tirosinasa (Hidalgo-Hidalgo-de-Cisneros, J. L. et al, Patent P200100556, Spain, March 2001; Cordero-Rando, M. M. et al. Analytical Chemistry 74(2002)2423-2427; Cordero-Rando, M. M. et al. Electroanalysis 17(2005)806-814; EL Kaoutit, et al. Biosensors & Bioelectronics 22(2007)2958-2966).

Generalmente en los procesos clásicos que se suelen usar para lograr los materiales sol-gel (Collinson, M.M. et al, Analytical Chemistry 72, pp. 702A-709A; Jin, W. et al, Analytica Chimica Acta 461, pp. 1-36) o los compuestos cerámicos sol-gel (Sampath, S. et al. Analytical Chemistry 68, pp. 2015-2021, Pankratov, I. et al, pp. Journal of Electroanalytical Chemistry 393, pp. 35-41) el uso del alcohol es imprescindible para homogeneizar las dos fases constituyentes del sol, que son el alcóxido y el agua, lo cual conlleva a un fenómeno inevitable llamado skrinkage-fenomenon que impide el control del volumen del material y el tamaño de los poros en el mismo (Lev, O. Analysis 20, pp. 543-553). Esa desventaja es muy limitante si se pretende usar el material sol-gel así sintetizado para el desarrollo de sensores o biosensores amperométricos. Una manera elegante de lograr un material sol-gel compacto, con tamaño de poros estable y textura fina es el uso de ultrasonidos de alta potencia para homogeneizar las dos fases. En nuestra patente antes citada, hemos comunicado el uso de esta tecnología para fabricar sensores electroquímicos (electrodos) cerámicos donde la conductividad eléctrica está asegurada gracias al fenómeno de percolación entre los granos de carbono introducidos en el material sonogel así sintetizado. La bio-compatibilidad de este compuesto cerámico con la enzima tirosinasa fue comunicada en nuestro artículo: El Kaoutit, et al. Biosensors & Bioelectronics 22(2007)2958-2966. Los resultados fueron muy competitivos con otros diseños de biosensores enzimáticos publicados en la bibliografia. Nuestra investigación en este sentido nos llevó a concluir que nuestro material sonogel-carbono es más bio-compatible con la enzima lacasa que con otras enzimas.

El biosensor que proponemos (Sonogel-Carbono a base de Lacasa) se ha sometido a ensayos para medir polifenoles en muestras de cervezas (muestras caracterizadas por su inestabilidad, complejidad e incluso por su efecto inhibidor de los elementos de reconocimiento biológico) y ha demostrado su capacidad para obtener un índice bio-electroquímico de polifenoles muy repetitivo, muy preciso y correlacionado con el índice clásico basado sobre el uso del reactivo de Folin-Ciocalteu.

Prácticamente todos los trabajos comunicados en la bibliografía usan la tirosinasa como elemento de reconocimiento biológico de base para fabricar biosensores para medir el índice de polifenoles en cervezas. Sin embargo una revisión profunda del mecanismo bio-catalítico de la tirosinasa nos puede llevar a concluir que este enzima además de no ser sensible a todos los polifenoles, es específica sólo a los flavanol-3-oles y demuestra una reducción de su poder catalizador en presencia de los polifenoles ácidos. Además, el pH de funcionamiento óptimo de la enzima está alrededor de 7, lo cual implica un cambio de pH de las muestras de cerveza para poder realizar la medida (pH de la cervezas cerca de 4.5) e impide el uso de los biosensores basados en tirosinasa para medidas in situ. Todas esas desventajas fueron superadas por nuestro biosensor a base de la lacasa, ya que esta enzima cataliza prácticamente la conversión de todas las familias de polifenoles existentes en la cerveza y que el pH óptimo de su funcionamiento está alrededor del pH de esas muestras.

Explicación de la invención

La novedad principal del procedimiento desarrollado consiste en el uso por primera vez de la enzima lacasa como elemento de reconocimiento biológico en un biosensor amperométrico diseñado para determinar el índice bio-electroquímico de polífenoles en cervezas. La bio-compatibilidad de este enzima con nuestro material sonogel-carbono, con nuestra matriz de inmovilización totalmente nueva y con el medio de medida, explica las ventajas de esta invención.

Las ventajas que presenta el nuevo biosensor aquí desarrollado sobre los preparados de forma habitual son varias e importantes:

ding{51}A diferencia del biosensor a base de la tirosinasa y nuestro material sonogel-carbono comunicado en: El Kaoutit, et al. Biosensors & Bioelectronics 22(2007)2958-2966, el biosensor a base de la lacasa y el mismo material demostró una gran estabilidad en las muestras de interés gracias a la concordancia entre los puntos isoeléctricos de los dos componentes del biosensor: el sonogel-carbono elaborado por vía de catálisis ácida y la enzima con un pI cerca de 4. ding{51}El uso de una mezcla, de proporción másica optimizada, de Glutaradialdehído y Nafion para inmovilizar la enzima sobre la superficie del Sonogel-Carbono, genera ventajas de estabilidad y bio-compatibilidad. Debido al efecto sinérgico de los dos compuestos, el primero como matriz perfecta de entrecruzamiento y el segundo como aditivo protector que genera, gracias a su estructura de carácter híbrido entre hidrofóbico e hidroflico, una matriz perfecta para el libre movimiento de la enzima y su protección de los productos fenólicos derivados que dañan la superficie del electrodo y los centros activos de la enzima. ding{51}El uso de los biosensores así fabricados para medir los polifenoles en cervezas, como muestra típica de alimentos complejos e inestables, demostró el potencial de la metodología desarrollada para lograr el objetivo propuesto. ding{51}La comparación del método aquí desarrollado para medir los polifenoles en cervezas con el método clásico de Folin-Ciocalteu demuestra grandes ventajas sobre ese método. El tiempo, el coste, la precisión, la posible adaptación a medidas in situ, la posibilidad de automatización, etc., son aspectos a destacar.

Modo de realización de la invención

Aparatos, materiales y reactivos

ding{51}La síntesis de los sonosoles se llevó a cabo mediante insonación con un generador de ultrasonidos de alta potencia, 20 kHz ultasonic processor (Misonix Inc., Farmingdale,...

Reivindicaciones:

1. Nuevo biosensor amperométrico basado en la combinación de la enzima Lacasa y materiales Sonogel-Carbono.

2. Procedimiento de fabricación de un nuevo biosensor amperométrico basado en la combinación de la enzima Lacasa y materiales Sonogel-Carbono, caracterizado porque tras la fabricación del transductor electroquímico "electrodo" mediante sonocatálisis, se realiza la funcionalización biológica del electrodo, que comprende las siguientes etapas: Disolución de la enzima Lacasa en la disolución reguladora adecuada; adición de glutaraldehído en la cantidad previamente calculada y polimerización en baño de ultrasonidos; adición de Nafion en cantidad adecuada; homogeneización de la mezcla; deposición sobre la superficie del electrodo mediante microjeringa de la cantidad requerida de esta mezcla para obtener los porcentajes de recubrimiento deseados.

3. Uso del nuevo biosensor amperométrico basado en la combinación de la enzima Lacasa y materiales Sonogel-Carbono, según reivindicaciones 1 y 2, para determinar el índice bio-electroquímico de polifenoles en cervezas, en bebidas y en extractos vegetales en general.

4. Uso del nuevo biosensor amperométrico basado en la combinación de la enzima Lacasa y materiales Sonogel-Carbono, según reivindicaciones 1 y 2, en tratamiento de aguas residuales o corrientes y en bio-síntesis de productos de alta pureza.

Patentes similares o relacionadas:

Cultivo de tejido tridimensional heterogéneamente diferenciado, del 22 de Julio de 2020, de IMBA-INSTITUT FÜR MOLEKULARE BIOTECHNOLOGIE GMBH: Un cultivo de tejido neuronal tridimensional artificial cultivado in vitro que comprende una población heterogénea de células humanas o células de primate no humanas […]

Gangliósidos para estandarizar y aumentar la sensibilidad de las células a las neurotoxinas botulínicas en los sistemas de prueba in vitro, del 15 de Julio de 2020, de MERZ PHARMA GMBH & CO. KGAA: Un método para determinar la actividad biológica de un polipéptido de neurotoxina, que comprende las etapas de: a) cultivar neuronas de diferentes […]

Procedimiento para evaluación de la función hepática y el flujo sanguíneo portal, del 15 de Julio de 2020, de The Regents of the University of Colorado, a body corporate: Procedimiento in vitro para la estimación del flujo sanguíneo portal en un individuo a partir de una única muestra de sangre o suero, comprendiendo el procedimiento: […]

ANTICUERPO MONOCLONAL O UNA PORCIÓN DE UNIÓN A ANTÍGENO DEL MISMO QUE SE UNE A LA PROTEÍNA L DEL VIRUS PARAINFLUENZA HUMANO (PIV); MÉTODO Y KIT PARA DETECTAR AL VIRUS PIV, del 2 de Julio de 2020, de PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE: La invención presenta la generación de anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteína L del virus parainfluenza humano (PIV), donde dichos […]

ANTICUERPOS MONOCLONALES ESPECÍFICOS PARA EL ANTÍGENO PB2 DEL VIRUS DE LA INFLUENZA HUMANA (FLU), SECUENCIAS NUCLEOTÍDICAS; MÉTODO Y KIT DE DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN PRODUCIDA POR FLU, del 2 de Julio de 2020, de PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE: La invención presenta la generación de anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteína PB2 del virus de la influenza humana (Flu), […]

Reactivos SIRP-alfa de alta afinidad, del 24 de Junio de 2020, de THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY: Un polipéptido SIRPα de alta afinidad que comprende al menos una y no más de 15 modificaciones de aminoácidos dentro del dominio d1 de una secuencia SIRPα de tipo […]

Diagnóstico y terapia de cáncer que implica células madre cancerosas, del 24 de Junio de 2020, de BioNTech SE: Un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a Claudina 6 (CLDN6) para usar en un método de tratamiento o prevención del cáncer que comprende inhibir y/o eliminar […]

Nueva inmunoterapia contra diversos tumores como el cáncer gastrointestinal y gástrico, del 24 de Junio de 2020, de IMMATICS BIOTECHNOLOGIES GMBH: Péptido seleccionado del grupo siguiente: a) péptido consistente en la secuencia conforme a la SEQ ID N.º 86, b) el péptido conforme a a), en la […]