MODULOS DE UNION A CARBOHIDRATOS.

Módulo de unión a carbohidratos que es

(a) un polipéptido codificado por la secuencia de ADN de posiciones 109-531 de la SEC ID NO:

1, o una secuencia de ADN homóloga a la SEC ID NO:1, donde la secuencia de ADN tiene al menos un 50% de identidad con las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1 o

(b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones 34-174 de SEC ID NO:2, o un polipéptido homólogo a la SEC ID NO:2, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de al menos un 50% de identidad con las posiciones 34-174 de la SEC ID NO:2 o

(c) un polipéptido codificado por una secuencia de ADN que se hibridiza a la secuencia de ADN de las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1 bajo condiciones de astringencia media o

(d) un polipéptido codificado por una molécula de polinucleótidos aislada cuya molécula de polinucleótidos se hibrida a una sonda de ADN bicatenario desnaturalizada bajo condiciones de astringencia media, donde la sonda consiste en la secuencia mostrada en las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1

Módulos de unión a carbohidratos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a módulos de unión a carbohidratos no catalíticos (CBM) de una familia nueva de CBM's. Un CBM de la invención fue descubierto fijado a un polipéptido de familia 61 de glicosil hidrolasa (GH61) y demostró tener poca homología con CBM's conocidos lo que indica que es el primer elemento conocido por una familia nueva de CBM's. La presente invención además se refiere a CBM's que preferiblemente presentan afinidad de enlace a celulosa; a un método para producir CBM's de este tipo; y a métodos para usar CBM's de este tipo en la industria textil, de detergentes y de tratamiento de fibras de celulosa, para la purificación de polipéptidos, inmovilización de enzimas activas, cocción, fabricación de biocombustible, modificación de paredes celulares vegetales.

Antecedentes de la invención

Un módulo de unión a carbohidratos (CBM) es definido como una secuencia de aminoácidos contigua dentro de una enzima activa de carbohidratos con un pliegue específico que tiene actividad de unión a carbohidratos. El requisito de CBM's existentes como módulos dentro de enzimas más grandes sitúa a esta clase de proteínas de unión a carbohidratos aparte de otras proteínas de unión a azúcar no catalíticas tales como lectinas y proteínas de transporte de azúcar.

Los CBM's fueron previamente clasificados como dominios de unión a la celulosa (CBD's) basándose en el descubrimiento inicial de diferentes módulos que se unen a la celulosa (Tomme et al. (1989) FEBS Lett. 243, 239-243; Gilkes et al. (1988) J. Biol. Chem. 263, 10401-10407). No obstante, se está descubriendo continuamente que módulos adicionales en enzimas activas sobre carbohidratos se unen a carbohidratos distintos de celulosa y sin embargo reúnen los criterios de CBM's.

La clasificación precedente de los dominios de unión a la celulosa se basó en la similitud de aminoácidos. Agrupamientos de CBD's fueron denominados "Tipos" y numerados con números romanos (p. ej. CBD's de tipo I o tipo II). Continuando con la clasificación de glucósido hidrolasa, estos agrupamientos son entonces llamados familias y numerados con números árabes. Las Familias 1 a 13 equivalen a los tipos I a XIII (Tomme et al. (1995) en Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (Saddler & Penner eds.) 142-163, American Chemical Society, Washington).

Actualmente los CBM's conocidos son clasificados en familias 1-6 y 8-33. Muchos CBM's clasificados son de origen bacteriano, y los módulos de unión a carbohidratos fúngicos conocidos son principalmente clasificados en la familia CBM1. No obstante, representantes de CBM's fúngicos son también descubiertos en CBM13, CBM18, CBM19, CBM20 y CBM24. Hasta ahora, sólo los módulos de unión a carbohidratos fúngicos de CBM1 fueron conocidos para unirse a la celulosa cristalina. Los CBM's fúngicos de familias CBM13, CBM18, CBM19, CBM20 y CBM24 han sido mostrados para unirse a sustratos tales como quitina, almidón y mutano. No obstante, también los módulos de unión a carbohidratos fúngicos de CBM1 se unen muy bien a quitina.

Varias celulasas fúngicas han demostrado contener un CBD de la familia CBM1 que consiste en 36 residuos aminoácidos. Ejemplos de enzimas conocidos para contener este dominio son:

1. Módulo de unión a carbohidratos que es

(a) un polipéptido codificado por la secuencia de ADN de posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1, o una secuencia de ADN homóloga a la SEC ID NO:1, donde la secuencia de ADN tiene al menos un 50% de identidad con las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1 o

(b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones 34-174 de SEC ID NO:2, o un polipéptido homólogo a la SEC ID NO:2, donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de al menos un 50% de identidad con las posiciones 34-174 de la SEC ID NO:2 o

(c) un polipéptido codificado por una secuencia de ADN que se hibridiza a la secuencia de ADN de las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1 bajo condiciones de astringencia media o

(d) un polipéptido codificado por una molécula de polinucleótidos aislada cuya molécula de polinucleótidos se hibrida a una sonda de ADN bicatenario desnaturalizada bajo condiciones de astringencia media, donde la sonda consiste en la secuencia mostrada en las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1.

2. Molécula de polinucleótido aislada codificando un polipéptido que tiene actividad de unión a carbohidratos seleccionada del grupo que consiste en:

(a) moléculas de polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID NO:1 desde el nucleótido 109 hasta el nucleótido 531;

(b) moléculas de polinucleótidos que codifican un polipéptido que es más de un 50% idéntico a la secuencia de aminoácidos de las posiciones 34-174 de la SEC ID NO:2; o un fragmento de la misma que tiene actividad de unión a carbohidratos;

(c) moléculas complementarias para (a) o (b); y

(d) secuencias de nucleótidos degeneradas de (a) o (b).

3. Molécula de polinucleótido aislada que codifica un polipéptido que tiene actividad de unión a carbohidratos cuya molécula de polinucleótido se hibrida a una sonda de ADN bicatenaria desnaturalizada bajo condiciones de astringencia media, donde la sonda consiste en la secuencia mostrada en las posiciones 109-531 de la SEC ID NO:1.

4. Molécula de polinucleótido aislada según la reivindicación 2 que es aislada de o producida basándose en una biblioteca de ADN de un procariota, tal como una bacteria o un eucariota, tal como un hongo o levadura.

5. Constructo polinucleótido que comprende la molécula de polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 2-4.

6. Constructo polinucleótido según la reivindicación 5 que comprende una o más secuencias de control, tal como un promotor, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, un péptido señal, un propéptido y una secuencia del terminador de transcripción.

7. Vector de expresión que comprende los elementos siguientes operativamente enlazados: un promotor de la transcripción; un segmento de ADN seleccionado del grupo que consiste en (a) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad de unión a carbohidratos que comprende una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID NO:1 de nucleótidos 109-531, (b) moléculas de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene actividad de unión a carbohidratos que son más de un 50% idénticas a la secuencia de aminoácidos de la posición 34-174 de SEC ID NO:2 o un fragmento de la misma que tiene actividad de unión a carbohidratos; y (c) secuencias de nucleótidos degeneradas de (a) o (b); y un terminador de la transcripción.

8. Célula cultivada en la que ha sido introducido un vector de expresión según la reivindicación 7, donde dicha célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN.

9. Método para producir un polipéptido que tiene actividad de unión a carbohidratos comprendiendo el cultivo de una célula según la reivindicación 8, por la cual dicha célula expresa un polipéptido codificado por el segmento de ADN; y recuperar el polipéptido.

10. Composición que comprende un módulo de unión a carbohidratos según la reivindicación 1 o 2.

11. Composición según la reivindicación 10 comprendiendo además una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en proteasas, celulasas, beta-glucanasas, hemicelulasas, lipasas, peroxidasas, lacasas, alfa-amilasas, glucoamilasas, cutinasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, pectato liasas, xiloglucanasas, xilanasas, pectina acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, pectina liasas, otras mananasas, pectina metil-esterasas, celobiohidrolasas, transglutaminasas; o mezclas derivadas.

12. Método para degradar biomasa con celulosa, donde la biomasa es tratada con una cantidad eficaz del módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de reivindicaciones 1 o 2 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11.

13. Endoglucanasa híbrida, que presenta actividad endo-beta-1,4-glucanasa que comprende un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y un dominio catalítico.

14. Composición que comprende un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o la endo-glucanasa híbrida según la reivindicación 13.

15. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o la endo-glucanasa híbrida según la reivindicación 13 en una composición detergente.

16. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o la endoglucanasa híbrida según la reivindicación 13 en procesos de acabado textil.

17. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para purificación de polipéptidos.

18. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para inmovilización de enzimas activas.

19. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para panadería.

20. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para fabricación de biocombustible.

21. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para modificación de paredes celulares vegetales.

22. Uso de un módulo de unión a carbohidratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para tratamiento de fibras de celulosa.