MICROORGANISMO QUE PRODUCE L-AMINOACIDOS Y PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-AMINOACIDOS.

Microorganismo que presenta una capacidad productora de L-aminoácidos,

en el que dicho microorganismo es modificado de manera que la expresión de un gen ybjE es potenciada, en el que dicho gen ybjE es seleccionado de entre el grupo que consiste en:

(a) un ADN que comprende una secuencia nucleótida de SEC ID nº:1;

(b) un ADN que puede hibridizarse, bajo condiciones estrictas, con una secuencia nucleótida de SEC ID nº:1, y en el que dicho ADN codifica una proteína que presenta una capacidad exportadora de L-aminoácidos;

(c) un ADN que presenta una secuencia nucleótida de los nucleótidos números 49 a 948 en la SEC ID nº:1; y

(d) un ADN que puede hibridizarse, bajo condiciones estrictas, con una secuencia nucleótida de los nucleótidos números 49 a 948 en la SEC ID nº:1, y en el que dicho ADN codifica una proteína que presenta una capacidad exportadora de L-aminoácidos

Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W05001650JP.

Solicitante: AJINOMOTO CO., INC..

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 15-1, KYOBASHI 1-CHOME, CHUO-KU, TOKYO 104-8315.

Inventor/es: UEDA,TAKUJI C/O AJINOMOTO CO.,INC, NAKAI,YUTA C/O AJINOMOTO CO.,INC, GUNJI,YOSHIYA C/O AJINOMOTO CO.,INC, TAKIKAWA,RIE C/O AJINOMOTO CO.,INC, JOE,YUJI C/O AJINOMOTO CO.,INC.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 23 de Septiembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/245 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Escherichia (G).
  • C12P13/04 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › alfa- o beta-Aminoácidos.
  • C12P13/08 C12P 13/00 […] › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.
  • C12P13/10 C12P 13/00 […] › Citrulina; Arginina; Ornitina.

Clasificación PCT:

  • C07K14/245 C07K 14/00 […] › Escherichia (G).
  • C12N1/19 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N1/20 C12N 1/00 […] › Bacterias; Sus medios de cultivo.
  • C12P13/04 C12P 13/00 […] › alfa- o beta-Aminoácidos.
  • C12P13/08 C12P 13/00 […] › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.
  • C12P13/10 C12P 13/00 […] › Citrulina; Arginina; Ornitina.
  • C12R1/15 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Corynebacterium.

Clasificación antigua:

  • C12P13/00 C12P […] › Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno.
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MICROORGANISMO QUE PRODUCE L-AMINOACIDOS Y PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-AMINOACIDOS.

Fragmento de la descripción:

Microorganismo que produce L-aminoácidos y procedimiento para producir L-aminoácidos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir un L-aminoácido mediante fermentación utilizando un microorganismo. Específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir L-aminoácidos tales como L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, L-isoleucina, L-treonina, L-prolina, L-fenilalanina, L-cisteína y ácido L-glutámico. Estos son L-aminoácidos industrialmente útiles. Principalmente, la L-lisina, L-treonina, L-isoleucina y L-prolina son útiles como aditivos para la alimentación animal, componentes de alimentos saludables, e infusiones de aminoácidos. La L-arginina y L-ornitina son útiles como agentes que promueven la función hepática, infusiones de aminoácidos, y componentes de preparaciones que contienen aminoácidos. La L-histidina es útil como un agente promotor de la función hepática y como precursor de la histamina. La L-fenilalanina es útil como precursor de edulcorantes.

Antecedentes de la técnica

Los L-aminoácidos se producen industrialmente mediante fermentación, utilizando microorganismos que pertenecen al género Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia o similares.

Se ha informado de procedimientos para producir L-lisina en las patentes EP 0857784A, JP 11-192088A, WO00/53726, y WO96/17930. Se ha informado de procedimientos para producir L-arginina en EP 0999267A, EP 1170358A, y JP 2002-017342A. En estos procedimientos en los que se informa, se utilizaron cepas bacterianas productoras de L-aminoácidos básicos, incluyendo cepas separadas de la naturaleza o sus cepas artificialmente mutadas, y cepas recombinantes que poseen actividad potenciada de una enzima biosintética de un L-aminoácido básico.

Además, también se ha informado de procedimientos para producir L-aminoácidos a partir del metanol, que está disponible para la fermentación en grandes cantidades y a un bajo coste, utilizando una cepa de un microorganismo mutado o modificado genéticamente, que pertenece al género Methylophilus o Methylobacillus (WO00/61723 y JP 2001-120269A).

Es conocido que los procedimientos para modificar la absorción o la exportación de L-aminoácidos en las células bacterianas han mejorado la capacidad de las bacterias para producir L-aminoácidos. Los procedimientos para modificar la absorción de los L-aminoácidos incluyen la eliminación o la disminución de la absorción de un L-aminoácido en las células para potenciar la capacidad productora de L-aminoácidos. Específicamente, estos procedimientos incluyen uno para "borrar" el operón gluABCD, o una parte del mismo, para eliminar o atenuar la absorción del ácido L-glutámico (EP 1038970A).

Los procedimientos para modificar la exportación incluyen la eliminación o reducción de la exportación de un intermediario o de un sustrato de la biosíntesis del L-aminoácido, y un procedimiento para potenciar la exportación de un L-aminoácido producido. Como un procedimiento para eliminar o reducir la exportación de un intermediario de la biosíntesis del ácido L-glutámico, se conoce un procedimiento para mutar o interrumpir el gen de la a-cetoglutarato permeasa para reducir una exportación del ácido a-cetoglutárico (W001/005959).

Como un procedimiento para potenciar la exportación de un L-aminoácido, resulta conocido un procedimiento para potenciar el gen lysE (un gen para la exportación de un L-aminoácido básico; J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 1999 Nov; 1(2):327-36) en una cepa de la bacteria Corynebacterium, para producir L-lisina (WO97/23597) o la L-arginina (Publicación de patente US 2003-0113899). Asimismo, resulta conocido un procedimiento para potenciar la expresión de los genes rhta, B, C, (JP-2000-189177A) y de los genes yfiK, yahN (EP 1016710A), que se ha sugerido están implicados en la exportación de los L-aminoácidos, en las células de bacteria Escherichia.

Como un gen para exportar los L-aminoácidos básicos, resulta conocido el gen lysE mencionado anteriormente. Sin embargo, cuando un gen lysE se amplifica en una bacteria asimiladora del metanol tal como la bacteria Methylophilus, y la cepa resultante se utiliza para la producción de la L-lisina o de la L-arginina, un gen lysE de tipo salvaje derivado de una bacteria corineforme es letal para la bacteria Methylophylus, y, por lo tanto, es necesario introducir un gen lysE mutante (EP 1266966A) que permite el desarrollo del microorganismo huésped. Por tanto, el gen lysE no puede funcionar siempre en la exportación de la L-lisina o de la L-arginina cuando se introduce en microorganismos heterogéneos. Por tanto, es deseable obtener un gen para el L-aminoácido exportador y la producción que muestre una capacidad para secretar suficientes cantidades de L-aminoácidos, incluyendo la L-lisina y la L-arginina, en distintos microorganismos huésped heterogéneos.

El gen ybjE se localiza en el genoma de Escherichia coli y se ha predicho que codifica una proteína superficial putativa Science, 277 (5331): 1453-74, 1997). Sin embargo, no se ha informado de la clonación del gen y su análisis mediante la expresión en las células bacterianas, y por tanto, sus funciones fisiológicas han permanecido desconocidas.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una cepa bacteriana que pueda producir eficientemente un L-aminoácido. Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para producir eficientemente un L-aminoácido utilizando dicha cepa.

En el contexto de la presente invención se ha estudiado asiduamente para conseguir los objetivos mencionados anteriormente, y como resultado, se obtuvo el gen ybjE, un gen nuevo para la exportación de L-aminoácidos, basado en la resistencia a altas concentraciones de L-lisina. Además, se ha descubierto que los L-aminoácidos, incluyendo L-aminoácidos básicos tales como L-lisina, L-arginina, L-ornitina, y L-histidina; L-aminoácidos alifáticos tales como L-isoleucina; L-aminoácidos hidroxílicos tales como L-treonina; L-aminoácidos circulares, tales como L-prolina; L-aminoácidos aromáticos tales como L-fenilalanina; L-aminoácidos que contienen azufre, tales como L-cisteína; y L-aminoácidos ácidos tal como el ácido L-glutámico, pueden ser producidos eficientemente utilizando un microorganismo en el cual se potencia la expresión del gen ybjE.

Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un microorganismo que tiene la capacidad de producir L-aminoácidos, en el que dicho microorganismo se modifica, de forma que la expresión de un gen ybjE se potencia.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en el que la expresión de dicho gen ybjE se potencia aumentando el número de copias de dicho gen ybjE, o modificando una secuencia reguladora de expresión de dicho gen ybjE.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en el que la secuencia aminoácida de una proteína codificada por dicho ybjE es tal como se define en SEC 2, y en el que dicha proteína posee la capacidad de exportación de un L-aminoácido.

En la presente invención, el gen ybjE se selecciona de entre el grupo que consiste en:

    (a) un ADN que comprende una secuencia nucleótida de SEC ID nº:1; y
    (b) un ADN que puede hibridizarse bajo condiciones severas con una secuencia nucleótida de SEC ID nº: 1, y en el que dicho ADN codifica una proteína que tiene una capacidad exportadora de un L-aminoácido.
    (c) un ADN que tiene una secuencia nucleótida de 49 a 948 nucleótidos en SEC ID nº:1, y
    (d) un ADN que puede hibridizarse bajo condiciones severas con una secuencia nucleótida de 49 a 948 en SEC ID nº:1, y en el que dicho ADN codifica una proteína que posee una capacidad exportadora del L-aminoácido.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar el microorganismo tal como se ha indicado anteriormente, en el que dicha capacidad de exportación del L-aminoácido, por dicho microorganismo, aumenta mediante dicha potenciación de dicho gen ybjE.

Otro objetivo de la presente...

 


Reivindicaciones:

1. Microorganismo que presenta una capacidad productora de L-aminoácidos, en el que dicho microorganismo es modificado de manera que la expresión de un gen ybjE es potenciada, en el que dicho gen ybjE es seleccionado de entre el grupo que consiste en:

    (a) un ADN que comprende una secuencia nucleótida de SEC ID nº:1;
    (b) un ADN que puede hibridizarse, bajo condiciones estrictas, con una secuencia nucleótida de SEC ID nº:1, y en el que dicho ADN codifica una proteína que presenta una capacidad exportadora de L-aminoácidos;
    (c) un ADN que presenta una secuencia nucleótida de los nucleótidos números 49 a 948 en la SEC ID nº:1; y
    (d) un ADN que puede hibridizarse, bajo condiciones estrictas, con una secuencia nucleótida de los nucleótidos números 49 a 948 en la SEC ID nº:1, y en el que dicho ADN codifica una proteína que presenta una capacidad exportadora de L-aminoácidos.

2. Microorganismo según la reivindicación 1, en el que la expresión de dicho gen ybjE se ha potenciado aumentando un número de copias de dicho gen ybjE, o modificando una secuencia reguladora de la expresión de dicho gen ybjE.

3. Microorganismo según la reivindicación 1 ó 2, en el que la secuencia aminoácida de una proteína codificada por dicho gen ybjE es seleccionada de entre el grupo que consiste en (A) a (D) que se muestra a continuación, en el que dicha proteína presenta una capacidad exportadora de L-aminoácidos.

    (A) una secuencia aminoácida de SEC ID nº:2,
    (B) una secuencia aminoácida de SEC ID nº:2, que incluye sustituciones, deleciones, o inserciones, de uno a 20 residuos aminoácidos
    (C) una secuencia aminoácida de los aminoácidos números 17 a 315 en la SEC ID nº:2, y
    (D) una secuencia aminoácida de los aminoácidos números 17 a 315 en la SEC ID nº:2, que incluye sustituciones, deleciones, o inserciones, de uno a 20 residuos aminoácidos.

4. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho gen ybjE presenta una mutación que reemplaza la guanina en la 3ª posición de la SEC ID n:º1 con la adenina.

5. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha capacidad exportadora de L-aminoácidos de dicho microorganismo aumenta mediante dicha potenciación de la expresión de dicho gen ybjE.

6. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que una resistencia del microorganismo a un L-aminoácido o análogo de L-aminoácido es aumentada mediante dicha potenciación de la expresión de dicho gen ybjE.

7. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho L-aminoácido es seleccionado de entre el grupo que consiste en L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, L-isoleucina, L-treonina, L-prolina, L-fenilalanina, L-cisteína, y ácido L-glutámico.

8. Microorganismo según la reivindicación 7, en el que dicho L-aminoácido es la L-lisina.

9. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho microorganismo pertenece a una familia de Enterobacteriáceas.

10. Microorganismo según la reivindicación 9, en el que dicho microorganismo que pertenece a una familia de Enterobacteriáceas, es un microorganismo que pertenece al género Escherichia.

11. Microorganismo según la reivindicación 10, en el que dicho microorganismo es Escherichia coli.

12. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho microorganismo es una bacteria Corineforme.

13. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho microorganismo es una bacteria que asimila metanol.

14. Microorganismo según la reivindicación 13, en el que dicha bacteria que asimila metanol es un microorganismo que pertenece al género Methylophilus o Methylobacillus.

15. Procedimiento para producir un L-aminoácido que comprende el cultivo del microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en un medio para producir y provocar la acumulación de dicho L-aminoácido, y recoger dicho L-aminoácido del medio o del microorganismo.

16. Procedimiento para producir un L-aminoácido, que comprende cultivar el microorganismo según la reivindicación 13 ó 14 en un medio líquido que contiene metanol como principal fuente de carbono para producir y provocar la acumulación de dicho L-aminoácido, y recoger el L-aminoácido del medio o del microorganismo.

17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, en el que el L-aminoácido es seleccionado de entre el grupo que consiste en L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-histidina, L-isoleucina, L-treonina, L-prolina, L-fenilalanina, L-cisteína y ácido L-glutámico.


 

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