Cepa de Escherichia coli productora de L-treonina que comprende el operón tdcBC y el gen pckA que están ambos inactivados

Microorganismo con genes pckA/tdcBC inactivados y método de producción de L-treonina usando el mismo.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un microorganismo que produce L-treonina y a un método de producción de L-treonina usando el microorganismo. Más particularmente, la presente invención se refiere a un microorganismo que contiene tanto el operón tdcBC como el gen pckA inactivados en el cromosoma y que está notablemente mejorado en la productividad de L-treonina debido a la inactivación de los dos genes, y a un método de producción de L-treonina usando un microorganismo de este tipo.

Se sabe que la L-treonina es un aminoácido esencial, que se ha usado ampliamente como aditivo para forraje y piensos para animales y como estimulador del crecimiento animal, así como componente de disoluciones acuosas médicas y otra materia prima para especialidades farmacéuticas. La L-treonina sólo la producen actualmente cinco empresas de países desarrollados, incluyendo la Ajinomoto Company en Japón, y es de dos a tres veces más cara que la lisina que se sabe que es sumamente valiosa debido a su elevado precio de 5.000-6.000 dólares por tonelada en el mercado internacional. Por tanto, la L-treonina tiene un gran potencial de crecimiento en el mercado mundial.

La L-treonina se produce actualmente sólo mediante técnicas de fermentación microbiana, usando principalmente mutantes derivados de tipos naturales de microorganismos, incluyendo Escherichia coli, el género Corynebacterium, el género Brevibacterium, el género Serratia y el género Providencia. Los ejemplos de estos mutantes incluyen aquéllos que tienen resistencia a análogos de aminoácido o fármacos, y sus auxótrofos para el ácido diamino-pimélico, metionina, lisina e isoleucina (publicación de patente japonesa n.º Heisei 2-219582; publicación de patente coreana n.º 2000-0013853, Appl. Microbiol. Biotechnol., 29:550-553, 1988). Sin embargo, tales cepas mutantes son desventajosas en cuanto a que presentan una baja productividad de L-treonina y que sólo se hacen crecer en medios complementados con los caros ácido diamino-pimélico o isoleucina debido a sus propiedades auxotróficas para el ácido diamino-pimélico o la isoleucina. Es decir, en el caso de usar un mutante que requiere ácido diamino-pimélico para su crecimiento, esta producción fermentativa de L-treonina requiere costes elevados. Asimismo, en el caso de usar un auxótrofo de isoleucina, el medio de fermentación para este auxótrofo debe complementarse con la cara isoleucina, dando como resultado un aumento de los costes de producción de la L-treonina.

Estos problemas pueden superarse usando un mutante parcial para isoleucina tal como se da a conocer en la publicación de patente coreana n.º 92-8365, que no necesita isoleucina en un medio y produce altos niveles de L-treonina con respecto a las cepas conocidas. Sin embargo, este método de mutación clásico requiere mucho tiempo y es ineficaz en la selección de cepas bacterianas novedosas que puedan producir altos niveles de L-treonina, y tiene la mayor desventaja de estar limitado en la mejora de la productividad de L-treonina.

A este respecto, en lugar de emplear los auxótrofos, se han desarrollado otros métodos para la producción masiva de L-treonina, que emplean microorganismos productores de L-treonina recombinantes que tienen un aumento de la actividad de enzimas que participan en la biosíntesis de L-treonina mediante técnicas de ingeniería metabólica. Es decir, se aíslan genes correspondientes a enzimas que están implicadas en el metabolismo de la L-treonina usando técnicas de recombinación genética, se clonan en vehículos génicos apropiados y se introducen en mutantes microbianos para mejorar la productividad de L-treonina de los mutantes.

Los presentes inventores desarrollaron previamente un método de desarrollo de una cepa productora de L-treonina usando tales técnicas de ingeniería metabólica, tal como se da a conocer en la solicitud de patente coreana n.º 2001-6976. En detalle, pueden conseguirse altos rendimientos de L-treonina empleando un microorganismo recombinante, que tiene en el cromosoma una o más copias de un gen que codifica para fosfoenol piruvato carboxilasa (a continuación en el presente documento, denominado simplemente "ppc") que cataliza la formación de oxaloacetato (OAA) como precursor para la biosíntesis de L-treonina a partir de fosfoenol piruvato (PEP) y un operón que incluye genes que codifican para las tres enzimas que participan en la biosíntesis de L-treonina a partir de aspartato, aspartocinasa 1-homoserina deshidrogenasa (thrA), homoserina cinasa (thrB) y treonina sintasa (thrC).

La L-treonina se sintetiza a partir de aspartato mediante una ruta de múltiples etapas, en la que se forma el aspartato a partir de OAA convertido por PPC a partir PEP. La biosíntesis de L-treonina se inhibe cuando está presente glucosa en niveles relativamente altos en los medios en comparación con la tasa de crecimiento bacteriano y la tasa global del ciclo del TCA. En esta situación, se suprime la expresión del gen ppc, mientras que aumenta la expresión de un gen que codifica para PEP carboxicinasa (a continuación en el presente documento, denominado simplemente "pckA") que cataliza la conversión de OAA en PEP. Los niveles elevados de pckA dan como resultado la formación de PEP a partir OAA como precursor para la biosíntesis de aminoácidos, en la que se sintetizan otros subproductos a partir del PEP (Goldie H. Medina V., Mol. Gen. Genet., 220(2):191-196, 1990; Dang et al., E. coli and Salmonella, 1:191-102, 1996). Por tanto, el gen pckA debe inactivarse esencialmente con el fin de producir L-treonina en altos niveles aumentando el flujo de rutas metabólicas responsables de la síntesis de L-treonina.

Por otro lado, se conocen varias rutas para la degradación de L-treonina, que incluyen las tres rutas siguientes. Una implica una ruta que la inicia la treonina deshidrogenasa produciendo a-amino-ß-cetobutirato. El a-amino-ß-cetobutirato o bien se convierte en acetil-CoA y glicina o bien se degrada espontáneamente para dar aminoacetona que se convierte en piruvato. La segunda ruta implica a la treonina deshidratasa que produce a-cetobutirato que se cataboliza adicionalmente para dar propionil-CoA y finalmente el intermedio del ciclo del TCA, succinil-CoA. La tercera ruta utiliza treonina aldolasa (Neidhardt F.C. et al. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2ª ed. ASM press. Washington DC, págs. 369-370). Entre ellas, la treonina deshidratasa es un operón que se expresa con hipoxia y altos niveles de treonina. Los presentes inventores desarrollaron un microorganismo con productividad mejorada de L-reonina inactivando específicamente este gen del operón (tdcBC) mediante una técnica de recombinación genética (publicación de patente coreana n.º 2003-075902).

Por otro lado, la publicación de patente internacional n.º WO 02/29080 A2 da a conocer un método de producción de L-treonina usando un microorganismo con el gen pckA defectuoso, que se prepara introduciéndolo en una cepa de tipo natural del microorganismo, un vector recombinante que porta un gen pckA parcialmente delecionado. Sin embargo, este microorganismo es problemático con respecto al rendimiento de producción de L-treonina porque las rutas para la degradación y el flujo de entrada intracelular de la L-treonina sintetizada están todavía activadas en el microorganismo.

La intensa y meticulosa investigación que condujo a la presente invención, llevada a cabo por los presentes inventores sobre métodos de preparación de un microorganismo que puede producir altos niveles de L-treonina incluso cuando se hace crecer en un medio que contiene altas concentraciones de glucosa y que no degrada la L-treonina producida, con el objetivo de resolver los problemas que se encontraban en la técnica anterior, dio como resultado el hallazgo de que, cuando se inactiva su gen pckA cromosómico mediante una técnica de recombinación genética, el microorganismo con el operón tdcBC desactivado desarrollado por los presentes inventores ha mejorado la productividad de L-treonina en comparación con los microorganismos productores de L-treonina convencionales.

Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un microorganismo que puede producir eficazmente altos niveles de...

1. Cepa de Escherichia coli productora de L-treonina que comprende el operón tdcBC y el gen pckA que están ambos inactivados.

2. Cepa de Escherichia coli según la reivindicación 1, en la que el gen pckA se inactiva introduciendo un gen pckA inactivado en una cepa de Escherichia coli original que contiene un operón asociado a la degradación de L-treonina, tdcBC, que está inactivado, en la que dicho gen pckA inactivado se prepara insertando un gen de resistencia a antibióticos que tiene un sitio de unión a recombinasa específica de sitio en cada uno de los dos extremos del mismo en un gen pckA y luego permitiendo la recombinación homóloga entre dicho gen pckA inactivado y el gen pckA en el cromosoma para inactivar el gen pckA cromosómico.

3. Cepa de Escherichia coli según la reivindicación 2, en la que el gen pckA se inactiva mediante la eliminación del gen de resistencia a antibióticos incorporado en el mismo mediante la actividad de la recombinasa específica de sitio expresada en la cepa de Escherichia coli y la presencia de una copia del sitio de unión de la recombinasa específica de sitio en el gen pckA cromosómico.

4. Cepa de Escherichia coli según la reivindicación 2, en la que la recombinasa específica de sitio es FLP, Cre o XerC/D.

5. Cepa de Escherichia coli según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la cepa es Escherichia coli FTR2717 (KCCM-10475).

6. Método de producción de L-treonina usando la cepa de Escherichia coli según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Plásmido recombinante pT7?pckA::loxpcat, preparándose el plásmido recombinante mediante la clonación de un gen pckA parcial de 1,5 kb en un vector pT7Blue para producir un pT7Blue/pckA, obteniéndose un fragmento de ADN que contiene un gen de resistencia a cloranfenicol y sitios loxP, loxpcat2, y el ligamiento del fragmento de ADN de loxpcat2 en el plásmido pT7Blue/pckA digerido con NruI.