Un aparato (10) que se puede usar en la síntesis de matrices de sondas de ADN y polipéptidos,

que comprende:

(a) un sustrato (12) con una superficie activa (15) sobre la que se pueden formar las matrices (16);

(b) un sistema formador (11) de imagen que proporciona una imagen luminosa bidimensional, de alta precisión, proyectada sobre la superficie activa del sustrato, que comprende:

(1) una fuente (25) de luz que proporciona un haz (27) de luz;

(2) un dispositivo (35) de microespejos que recibe el haz de luz procedente de la fuente y que está compuesto de una matriz de microespejos (36) que se pueden orientar electrónicamente, cada uno de los cuales puede inclinarse selectivamente entre una de al menos dos posiciones separadas, en el que en una de las posiciones de cada microespejo, la luz (33) procedente de la fuente incidente sobre el microespejo es desviada separándola del eje óptico (40), y en una segunda de al menos dos posiciones del microespejo, la luz es reflejada a lo largo del eje óptico (41), y

(3) un sistema óptico de proyección (60, 61, 63) que recibe la luz reflejada procedente de los microespejos a lo largo del eje óptico (41) y que forma la imagen del patrón de los microespejos sobre la superficie activa del sustrato, en el que el sistema óptico de proyección es telecéntrico y está compuesto de elementos ópticos reflectantes, y los elementos ópticos reflectantes incluyen un espejo cóncavo (60) y un espejo convexo (61), reflejando el espejo cóncavo la luz (41) procedente del dispositivo (35) de microespejos al espejo convexo que la refleja de vuelta al espejo cóncavo que refleja la luz al sustrato (12) donde se forma la imagen

Método y aparato para la síntesis de matrices de sondas de ADN.

Campo de la invención

Esta invención pertenece, de forma general, al campo de la biología y concretamente a técnicas y aparatos para el análisis y la secuenciación del ADN y polímeros relacionados.

Antecedentes de la invención

La secuenciación del ácido desoxirribonucleico (ADN) es una herramienta fundamental de la biología moderna y convencionalmente se lleva a cabo de diversas maneras, comúnmente por procedimientos que separan segmentos de ADN mediante electroforesis. Véase, por ejemplo, Current Protocols In Molecular Biology, Volumen 1, capítulo 7, "DNA Sequencing", 1995. Ya se ha completado la secuenciación de varios genomas importantes (por ejemplo, levadura, E. coli), y se está procediendo a trabajar en la secuenciación de otros genomas de importancia médica y agrícola (por ejemplo, C. elegans, Arabidopsis). En el contexto médico, será necesario "re-secuenciar" el genoma de gran número de individuos humanos para determinar qué genotipos están asociados con qué enfermedades. Tales técnicas de secuenciación se pueden usar para determinar qué genes son activos y cuales inactivos en tejidos específicos, tales como cánceres, o bien, de forma más general, en individuos que exhiben enfermedades influenciadas por la genética. Los resultados de tales investigaciones pueden permitir la identificación de las proteínas que son buenos objetivos para los nuevos fármacos o para la identificación de alteraciones genéticas apropiadas que puedan ser eficaces en la terapia genética. Otras aplicaciones se encuentran en campos tales como la ecología o la patología del terreno, donde será deseable ser capaces de aislar el ADN de cualquier muestra de terreno o de tejido, y usar sondas procedentes de secuencias de ADN ribosómico de todos los microbios conocidos para identificar los microbios presentes en la muestra.

La secuenciación convencional del ADN usando electroforesis es generalmente laboriosa y necesita tiempo. Se han propuesto diversas alternativas a la secuenciación convencional del ADN. Una de estas aproximaciones alternativas, que utiliza una matriz de sondas de oligonucleótidos sintetizados mediante técnicas fotolitográficas, está descrita por Pease y colaboradores, "Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA Sequence Analysis", Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. Volumen 91, páginas 5022-5026, Mayo 1994. En esta aproximación, se ilumina la superficie de un soporte sólido, modificado con grupos protectores fotolábiles, a través de una máscara fotolitográfica, produciendo grupos hidroxilo reactivos en las regiones iluminadas. Se le proporciona luego a la superficie un desoxinucleósido activado en posición 3', protegido en el hidroxilo 5' con un grupo fotolábil, de forma que se produzca un acoplamiento en los sitios que han estado expuestos a la luz. A continuación de la adición de la estructura casquete, y de la oxidación, el sustrato se enjuaga y la superficie se ilumina a través de una segunda máscara para exponer los grupos hidroxilo adicionales al acoplamiento. Se presenta a la superficie una segunda base de desoxinucleósido activado protegido en 5'. Los ciclos de fotodesprotección selectiva y acoplamiento se repiten para aumentar los niveles de bases hasta que se obtenga el conjunto de sondas deseado. Puede ser posible generar matrices miniaturizadas de sondas de oligonucleótidos, de alta densidad, usando estas técnicas fotolitográficas, en las que se conoce la secuencia de las sondas de oligonucleótidos en cada uno de los sitios de la matriz. Estas sondas se pueden usar luego para buscar secuencias complementarias sobre una cadena antiparalela de ADN, con la detección del antiparalelo que ha hibridado a sondas concretas llevado a cabo mediante el uso de marcadores fluorescentes acoplados a los antiparalelos, y la inspección mediante un apropiado microscopio de fluorescencia con barrido. McGall y colaboradores, en "Light-Directed Synthesis of High-Density Oligonucleotide Arrays Using Semiconductor Photoresists", Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., Volumen 93, páginas 13555-13560, Noviembre de 1996, y G. H. McGall y colaboradores en "The Efficiency of Light-Directed Synthesis of DNA Arrays on Glass Substrates", Journal of the American Chemical Society 119, nº 22, 1997, páginas 5081-5090.., describen una variación de este procedimiento que usa sustancias fotoprotectoras semiconductoras poliméricas que se configuran selectivamente mediante técnicas fotolitográficas, en vez de usar grupos protectores fotolábiles 5'.

Un inconveniente de ambas aproximaciones es que se necesitan cuatro máscaras litográficas diferentes para la base monomérica, y el número total de máscaras diferentes requeridas es, por tanto, cuatro veces la longitud de las secuencias de las sondas de ADN que se van a sintetizar. El alto coste para producir las muchas máscaras fotolitográficas de precisión que se requieren, y las múltiples etapas de tratamiento requeridas para volver a colocar las máscaras para cada exposición, contribuyen a los costes relativamente altos y a los largos tiempos de tratamiento.

El documento WO-A-93/22678 describe un método y describe aparatos para identificar estructuras moleculares dentro de una sustancia de muestra que usa una matriz monolítica de puntos de ensayo formados sobre un sustrato sobre el que se aplica la sustancia de muestra. Cada punto de ensayo incluye sondas allí formadas para unirse con una estructura o estructuras moleculares diana predeterminadas. Se aplica una señal a los lugares de ensayo y se detectan ciertas propiedades eléctricas, mecánicas y/o ópticas de los lugares de ensayo para determinar qué sondas se han unido a una estructura molecular diana asociada.

Sumario de la invención

Según la presente invención, la síntesis de las matrices de secuencias de sondas de ADN, polipéptidos, y similares, se lleva a cabo rápidamente y de forma eficaz usando procedimientos de formación de patrones. El procedimiento puede estar automatizado y controlado por ordenador para permitir la fabricación de una matriz uni- o bidimensional de sondas que contienen secuencias de la sonda adaptadas a una investigación concreta. No se requieren máscaras litográficas, eliminando de esta forma los costes significativos y los retrasos de tiempo asociados a la producción de las máscaras litográficas y evitando la manipulación y la alineación de las múltiples máscaras, lo que necesita tiempo, durante el proceso de fabricación de las matrices de sondas.

Según un aspecto de la invención, se proporciona un aparato que se puede usar en la síntesis de matrices de sondas de ADN y de polipéptidos, que comprende:

(a) un sustrato con una superficie activa sobre el cual se pueden formar las matrices;

(b) un sistema formador de imagen que proporciona una imagen luminosa bidimensional, de alta precisión, proyectada sobre la superficie activa del sustrato, que comprende:

1. Un aparato (10) que se puede usar en la síntesis de matrices de sondas de ADN y polipéptidos, que comprende:

(a) un sustrato (12) con una superficie activa (15) sobre la que se pueden formar las matrices (16);

(b) un sistema formador (11) de imagen que proporciona una imagen luminosa bidimensional, de alta precisión, proyectada sobre la superficie activa del sustrato, que comprende: