GENERACIÓN DE DIVERSIDAD DE RECUBRIMIENTOS DE SUPERFICIE.

Un método para la generación de una biblioteca de diferentes recubrimientos de superficie sobre un sustrato que incluye:

a) la selección de un sintón de recubrimiento de superficie con la fórmula B-S-F, en el que B es un copolímero de al menos un constituyente monomérico P y al menos un constituyente monomérico A, S es una unidad espaciadora y F es un grupo funcional capaz de actuar como punto para modificaciones químicas adicional de la superficie, en el que S se adhiere al constituyente monomérico A del copolímero B, y en el que el sintón tiene al menos un punto de diversidad seleccionado de entre P, A, S y F; b) la aplicación de el(los) recubrimiento(s) basal(es) del copolímero B seleccionado sobre un sustrato; c) la unión de la(s) combinación(es) seleccionada(s) de la unidad espaciadora S y el grupo funcional F al constituyente A del copolímero B de acuerdo con dicho sintón seleccionado; en el que los pasos b) y c) se llevan a cabo de tal manera que los recubrimientos de superficie de acuerdo con el sintón se generan en regiones localizadas del sustrato, proporcionado así dicha biblioteca de diferentes recubrimientos de superficie sobre el sustrato

Generación de diversidad de recubrimientos de superficie

Campo de la invención:

La presente invención está relacionada con la tecnología de los recubrimientos de superficie. En particular, la invención está relacionada con un método para generar una biblioteca de distintos recubrimientos de superficie sobre un sustrato; con un método para la optimización de una superficie de sustrato para su aplicación en fase sólida y matrices o cuentas que poseen distintas regiones de recubrimientos de superficie optimizados particulares.

Antecedentes de la invención:

La tecnología de recubrimientos de superficie actual proporciona un número relativamente limitado de superficies establecidas que pueden utilizarse en nuevas aplicaciones químicas o bioquímicas de fase sólida. La falta de superficies establecidas radica principalmente en la dificultad asociada a la generación de recubrimientos de superficie distintos. Mientras que actualmente se puede generar sin gran dificultad un gran número de compuestos químicamente distintos en solución, la habilidad para enlazar esas moléculas en una fase sólida y crear un gran número de recubrimientos de superficie ha supuesto un problema mucho más difícil de resolver. En particular, la química para enlazar moléculas sobre fases sólidas para crear recubrimientos de superficie es altamente imprevisible, y hasta la fecha, se ha mantenido más como un arte que como una ciencia.

Existen numerosas aplicaciones en las que sería ventajoso un rango diverso de recubrimientos de superficie novedosos, como por ejemplo en el área de los ensayos biológicos de fase sólida. Con el número de proteínas nuevas creciendo cada día, existe la creciente necesidad de superficies novedosas de fase sólida que sean compatibles con la inmovilización de estas macromoléculas complejas. Hasta la fecha, a pesar de esta necesidad, en la práctica tan sólo hay disponibles unas pocas superficies sólidas entre el amplio rango de aplicaciones en fase sólida utilizadas para estudiar moléculas biológicas. Por ejemplo, en el área de captura y exposición de biomoléculas, cada proveedor comercial tiene su propia realización para superficies en fase sólida que se prescribe en una amplia gama de aplicaciones específicas. Un ejemplo específico es una superficie generada utilizando la consolidada reacción química con PEG (polietilenglicol) como se describe en un artículo de Ruiz-Tailor et al. ("Monolayers of derivatized poli (L-lysine) -grafted poli (etilen glycol) on metal oxides as a class of biomolecular interfaces, " PNAS EEUU 98: 852-857 (2001) ) . Otro ejemplo es la relativamente reciente reacción química con complejos de ácido borónico utilizada para preparar superficies para la inmovilización de proteínas, descrita por Stolowitz et al. ("Fenilboronic Acid-Salicilhidroxamic Acid Bioconjugates. 1. A Novel Boronic Acid Complex for Protein Immobilización, " Bioconjugate Chemistr y 12: 229-239 (2001) ) .

Actualmente, la resonancia de plasmón superficial (SPR, del inglés surface plasmon resonance) se ha adoptado de forma general como técnica para la detección de interacciones de unión del tipo proteína-ligando y proteína-proteína. No obstante, la utilidad de la SPR en relación a un sistema de proteínas particular depende en gran medida de las peculiaridades con las que esa macromolécula se une a la superficie del sustrato sólido durante la inmovilización. Si una superficie de SPR particular provoca que una proteína de interés se una en una orientación desfavorable para la detección de la unión de los ligandos, sólo existe un puñado de superficies alternativas con un rango limitado de propiedades de unión de entre las cuales escoger (ver, por ejemplo Rich y Myszka "Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis, " Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61 (2000) ) .

De modo similar, hoy en día también se emplea extensamente la espectrometría de masas para el análisis de macromoléculas biológicas. Generalmente, estos métodos incluyen la inmovilización de una proteína sobre una superficie de un sustrato, en la que ésta se expone luego a una interacción de unión de ligando. A continuación de la unión (o no unión) a un ligando, la molécula se separa de la superficie y se absorbe en el espectrómetro utilizando un láser (ver, por ejemplo Merchant y Weinberger, "Recent advancements in surface-enhanced laser desorption/ionización-time of flight-mass spectrometr y , " Electrophoresis 21: 1164-1177 (2000) ) . Como en el experimento con SPR, el éxito del experimento de la espectrometría de masas depende en gran medida de la interacción entre la proteína inmovilizada y la superficie. En vista de los miles de proteínas con diferentes interacciones de superficie, existe la clara necesidad de un mayor número de superficies de sustrato distintas para que se pueda aplicar exitosamente la espectrometría de masas para el análisis de alto rendimiento del proteoma.

La patente WO 00/12575 describe un método para la síntesis paralela y combinatoria de compuestos unidos a un material de soporte de fase sólida, polimérico y continuo.

La patente US 6.403.368 describe un portaobjetos/ microchip mejorado hidrofílico con puntos en su superficie.

La patente WO 02/40171 describe un aparato y un método para la separación de una mezcla de sólidos que contienen metales.

La patente US 6.346.413 describe las estrategias sintéticas para la creación de diversidad química a gran escala.

La patente US 5.922.545 describe los métodos para la identificación de péptidos y anticuerpos de cadena simple que se unen a receptores o epítopos predeterminados.

La patente US 6.329.209 describe matrices de agentes que capturan proteínas.

Consecuentemente, la incapacidad para proporcionar una matriz diversa de recubrimientos de superficie representa un impedimento para el desarrollo de tecnologías biológicas en fase sólida, tales como los diagnósticos y ensayos biológicos, y biomateriales. Tal impedimento también se extiende sobre un amplio espectro de tecnologías, incluyendo la síntesis química en fase sólida, el desarrollo de la catálisis o las tecnologías de separación y purificación.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para la generación de una biblioteca de recubrimientos de superficie diferentes sobre un sustrato que incluye:

a) la selección de un sintón de recubrimiento de superficie con la fórmula B-S-F, en el que B es un copolímero de a menos un constituyente monomérico P y al menos un constituyente monomérico A, S es una unidad espaciadora y F es un grupo funcional capaz de actuar como punto para modificaciones adicionales de la superficie, en el que S se une a un constituyente monomérico A del copolímero B, y en el que el sintón tiene al menos un punto de diversidad seleccionado entre P, A, S y F;

b) la aplicación de un (os) recubrimiento (s) basal (es) del copolímero B seleccionado sobre un sustrato;

c) la unión de la (s) combinación (es) seleccionada (s) de la unidad espaciadora S y del grupo funcional F sobre el constituyente A del copolímero B de acuerdo con dicho sintón seleccionado;

en el que los pasos b) y c) se llevan a cabo de tal manera que los recubrimientos de superficie de acuerdo con el sintón se generan en regiones localizadas del sustrato, proporcionando así dicha biblioteca de diferentes recubrimientos de superficie sobre un sustrato.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la optimización de la superficie de un sustrato 35 para su aplicación en fase sólida, incluyendo la inmovilización de una molécula, que se basa en:

a) la generación de una biblioteca de recubrimientos de superficie distintos sobre un sustrato mediante un método que incluye:

1) la selección de un sintón de recubrimiento de superficie con la fórmula B-S-F, en el que B es un copolímero de al menos un constituyente P monomérico y a menos un constituyente A monomérico, S es una unidad espaciadora y F es un grupo funcional capaz de actuar como punto para modificaciones adicionales de la superficie, en el que S se une a un constituyente A monomérico del copolímero B, y en el que el sintón tiene al menos un punto de diversidad seleccionado entre P, A, S y F;

2) la aplicación de un (os) recubrimiento... [Seguir leyendo]

1. Un método para la generación de una biblioteca de diferentes recubrimientos de superficie sobre un sustrato que incluye:

a) la selección de un sintón de recubrimiento de superficie con la fórmula B-S-F, en el que B es un copolímero de al menos un constituyente monomérico P y al menos un constituyente monomérico A, S es una unidad espaciadora y F es un grupo funcional capaz de actuar como punto para modificaciones químicas adicional de la superficie, en el que S se adhiere al constituyente monomérico A del copolímero B, y en el que el sintón tiene al menos un punto de diversidad seleccionado de entre P, A, S y F;

b) la aplicación de el (los) recubrimiento (s) basal (es) del copolímero B seleccionado sobre un sustrato;

c) la unión de la (s) combinación (es) seleccionada (s) de la unidad espaciadora S y el grupo funcional F al 15 constituyente A del copolímero B de acuerdo con dicho sintón seleccionado;

en el que los pasos b) y c) se llevan a cabo de tal manera que los recubrimientos de superficie de acuerdo con el sintón se generan en regiones localizadas del sustrato, proporcionado así dicha biblioteca de diferentes recubrimientos de superficie sobre el sustrato.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sustrato se selecciona de entre un polímero orgánico, vidrio, silicona, metal y combinaciones de los mismos.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sustrato se presenta en forma de portaobjetos de 25 microscopio, placa de microtitulación, membrana porosa, punta de pipeta, tubo o numerosas cuentas.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el sustrato es un polímero orgánico.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el polímero orgánico se selecciona de entre 30 politetrafluoroetileno, poliestireno, polipropileno, polietileno, fluoruro de polivinilideno y polimetilmetacrilato.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el polímero orgánico se presenta en forma de numerosas cuentas.

35 7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que las cuentas se marcan de tal manera que se puede relacionar un recubrimiento particular con una cuenta particular o un subgrupo de cuentas.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que las cuentas son cuentas Luminex™.

40 9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la biblioteca incluye al menos 10 recubrimientos de superficie diferentes.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones1-8, en el que la biblioteca incluye al menos 100 recubrimientos de superficie diferentes.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones1-8, en el que la biblioteca incluye al menos 1.000 recubrimientos de superficie diferentes.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la biblioteca incluye al menos 10.000 50 recubrimientos de superficie diferentes.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el constituyente A del copolímero B es un residuo polimerizado de un compuesto seleccionado de entre aquellos que se enumeran en la Tabla 1 de esta descripción.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el constituyente A del copolímero B es un residuo polimerizado de anhídrido maleico.

15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el constituyente P del copolímero B

60 es un residuo polimerizado de un compuesto seleccionado de entre aquellos que se enumeran en la Tabla 2 de esta descripción.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el constituyente P del copolímero B es un residuo polimerizado de estireno.

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que copolímero B es un copolímero alterno.

18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que copolímero B es un copolímero en bloque del constituyente A y el constituyente P pasivo.

19. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que copolímero B es un copolímero de anhídrido maleico y estireno.

20. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que copolímero B además incluye un agente controlador C.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el agente controlador se selecciona de entre un agente controlador RAFT, un agente controlador ARTP y un agente controlador de nitróxido.

22. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en el que la unidad espaciadora S tiene la estructura:

X_Q_Y

en la que X es el residuo de un grupo amino, hidroxilo, tiol, ácido carboxílico, anhídrido, isocianato, cloruro de sulfonilo, anhídrido sulfónico, cloroformato, cetona o aldehído; Y es como se ha definido para X; y Q es un grupo orgánico divalente, y en la que X e Y no son reactivas entre sí o en relación a Q.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en el que Q se selecciona de entre alquilenos de C1 a C20 opcionalmente sustituidos, alquinilenos de C2 a C20 opcionalmente sustituidos, alquinilenos de C2 a C20 opcionalmente sustituidos y arilenos de C6 a C20 opcionalmente sustituidos, en el que uno o más átomos de carbono pueden sustituirse con un heteroátomo seleccionado de entre O, S o N.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 22 o la reivindicación 23, en el que la unidad espaciadora S es un residuo de una diamina.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la unidad espaciadora S es un residuo de una alquilodiamina.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que la unidad espaciadora S es un residuo de 1, 5diaminopentano o N- (3-aminopropil) -1, 3-propandiamina.

27. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, en el que el grupo funcional F es un grupo con capacidad de unirse o reaccionar químicamente con una molécula o componente biológico.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el grupo funcional F incluye un grupo de amina primaria

o secundaria.

29. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, en el que el sintón tiene, entre el constituyente A, el constituyente P, la unidad espaciadora S y el grupo funcional F, un único punto de diversidad en la selección de la unidad espaciadora S.

30. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, en el que el sintón tiene, entre el constituyente A, el constituyente P, la unidad espaciadora S y el grupo funcional F, un único punto de diversidad en la selección del grupo funcional F.

31. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, en el que el sintón tiene, entre el constituyente A, el constituyente P, la unidad espaciadora S y el grupo funcional F, dos puntos de diversidad en la selección de la unidad espaciadora S y el grupo funcional F.

32. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-31, en el que el (los) recubrimiento (s) basal (es) del copolímero B se aplican sobre el sustrato mediante enlace, u otros métodos de recubrimiento seleccionados de entre el recubrimiento por inmersión, la polimerización por plasma, deposición de vapor, impresión por sellado, irradiación gamma, exposición al haz de electrones, y radiación térmica y fotoquímica.

33. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, en el que la (s) combinación (es) de la unidad espaciadora S y el grupo funcional F se adhieren mediante:

1) la unión de la unidad espaciadora S al copolímero B y entonces, la unión del grupo funcional F al grupo espaciador S adherido; o

2) la unión de la unidad espaciadora S al copolímero B, en el que la unidad espaciadora S ya tiene unido el grupo funcional F.

34. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-33, en el que el (los) recubrimiento (s) basal (es) del copolímero B seleccionado se aplica (n) sobre regiones localizadas del sustrato.

35. El método de acuerdo con la reivindicación 34, el (los) recubrimiento (s) basal (es) del copolímero B seleccionado se aplica (n) a numerosas cuentas.

36. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-33, en el que el (los) recubrimiento (s) basal (es) del copolímero B seleccionado se aplica (n) sobre la superficie del sustrato, y la (s) combinación (es) seleccionadas de la unidad espaciadora S y el grupo funcional F se une (n) al copolímero B en regiones localizadas.

37. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, en el que los recubrimientos de superficie de acuerdo con el sintón que se han generado en regiones localizadas del sustrato se resuelven espacialmente.

38. Un método para la optimización de una superficie de sustrato para aplicaciones en fase sólida incluyendo la inmovilización de una molécula, que incluye:

a) la generación de una biblioteca de diferentes recubrimientos de superficie sobre un sustrato mediante un método que incluye:

1) la selección de un sintón de recubrimiento de superficie con la fórmula B-S-F, en el que B es un copolímero de al menos un constituyente P monomérico y al menos un constituyente A monomérico, S es una unidad espaciadora y F es un grupo funcional con capacidad de actuar como punto para modificaciones químicas adicionales de la superficie, en el que S se une al constituyente A de copolímero B, y en el que el sintón tiene al menos un punto de diversidad seleccionado de entre P, A, S y F;

2) la aplicación de el (los) recubrimiento (s) basal (es) del copolímero B seleccionado sobre un sustrato;

3) la unión de la (s) combinación (es) seleccionada (s) de la unidad espaciadora S y el grupo funcional F al constituyente A del copolímero B de acuerdo con dicho sintón seleccionado;

en el que los pasos 2) y 3) se llevan a cabo de tal manera que los recubrimientos de superficie de acuerdo con el sintón se generan en regiones localizadas del sustrato, proporcionado así dicha biblioteca de diferentes recubrimientos de superficie sobre el sustrato.

b) la exposición de al menos dos de los recubrimientos de superficie en la biblioteca a la molécula que se va a inmovilizar; y c) la determinación de cual de las al menos dos superficies da como resultado un mejor rendimiento de la molécula inmovilizada en la aplicación en fase sólida.

39. El método de la reivindicación 38 en el que la aplicación en fase sólida incluye la inmovilización de una molécula biológica o un análogo de una molécula biológica seleccionado de entre proteínas, péptidos, ácidos peptidonucleicos, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos no naturales, oligonucleótidos e hidratos de carbono.

40. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en el que la aplicación en fase sólida incluye la detección de la unión de un ligando a una molécula biológica inmovilizada.

41. Un método para la ejecución de la aplicación en fase sólida que incluye la inmovilización de una molécula sobre una superficie de sustrato optimizado mediante el método de la reivindicación 38.

42. Un método para la adaptación de un recubrimiento de superficie para que reconozca, se una o se asocie con una molécula particular que incluye:

a) la generación de una biblioteca de diferentes recubrimientos de superficie sobre un sustrato mediante un método que incluye:

1) la selección de un sintón de recubrimiento de superficie con la fórmula B-S-F, en el que B es un copolímero de al menos un constituyente P monomérico y al menos un constituyente A monomérico, S es una unidad espaciadora y F es un grupo funcional con capacidad de actuar como punto para modificaciones químicas adicionales de la superficie, en el que S se une al constituyente A de copolímero B, y en el que el sintón tiene al menos un punto de diversidad seleccionado de entre P, A, S y F;

2) la aplicación de el (los) recubrimiento (s) basal (es) del copolímero B seleccionado sobre un sustrato; 3) la unión de la (s) combinación (es) seleccionada (s) de la unidad espaciadora S y el grupo funcional F al constituyente A del copolímero B de acuerdo con dicho sintón seleccionado;

en el que los pasos 2) y 3) se llevan a cabo de tal manera que los recubrimientos de superficie de acuerdo con el 5 sintón se generan en regiones localizadas del sustrato, proporcionado así dicha biblioteca de diferentes recubrimientos de superficie sobre el sustrato.

b) la exposición de al menos dos de los recubrimientos de superficie en la biblioteca a la molécula particular; y c) la determinación de cual de las al menos dos superficies reconoce, se une o se asocia con la molécula particular.