METODO PARA MODIFICAR LA MORFOLOGIA, BIOQUIMICA Y FISIOLOGIA DE LAS PLANTAS.

Uso de un ácido nucléico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta para estimular el crecimiento radicular para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular

Método para modificar la morfología, bioquímica y fisiología de las plantas.

Campo de la invención

La presente especificación se relaciona en general con un método para modificar las propiedades o características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas de las plantas, tales como uno o más de sus procesos de desarrollo y/o sus procesos de adaptación al ambiente, incluyendo pero no limitándose a la modificación de la iniciación o estimulación o mejora del crecimiento de la raíz, y/o a la formación de raíces adventicias, y/o a la formación de raíces laterales, y/o al geotropismo de las raíces, y/o al crecimiento de brotes, y/o al dominio apical, y/o a la ramificación, y/o al periodo de senescencia, y/o al periodo de floración, y/o al periodo de formación de flores, y/o al desarrollo de semillas, y/o al rendimiento en semillas, comprendiendo dicho método a la expresión de una proteína de control de la degradación de la citoquinina, en particular la citoquinina oxidasa, en la planta, operablemente bajo el control de una secuencia promotora regulable, tal como una secuencia promotora específica para la célula, promotora específica para el tejido, o promotora específica para un órgano. Preferiblemente, las características modificadas por la presente invención son características mediadas por la citoquinina y/o mediadas por la auxina. La presente especificación se extiende a las construcciones genéticas que son útiles para llevar a cabo el método de la invención y a las plantas transgénicas producidas con el mismo que tienen propiedades morfológicas y/o bioquímicas y/o fisiológicas alteradas comparadas con sus contrapartes isogénicas.

Antecedentes de la invención

Las raíces son un órgano importante de las plantas superiores. Sus principales funciones son anclar la planta en el suelo y tomar el agua y los nutrientes (nutrición N, minerales, etc.). Así, el crecimiento de la raíz tiene una influencia directa o indirecta en el crecimiento y rendimiento de los órganos aéreos, particularmente bajo condiciones de limitación de nutrientes. Las raíces también son relevantes para la producción de productos vegetales secundarios, tales compuestos de defensa y hormonas vegetales.

Las raíces también son órganos de almacenamiento en un buen número de cultivos importantes. La remolacha de azúcar es la planta más importante para la producción de azúcar en Europa (260 millones de toneladas/año, 38% de la producción mundial). La mandioca (casaba), los ñames y las patatas dulces (batatas) son también productores de almidón importantes (aproximadamente 150 millones de toneladas/año cada una). Su contenido en almidón puede ser dos veces tan alto como el de la patata. Las raíces también son el órgano relevante para el consumo en un importante número de vegetales (por ejemplo, zanahorias, rábanos), hierbas (por ejemplo, jengibre, cúrcuma), y plantas medicinales (por ejemplo, ginseng). Además, algunos de los productos vegetales secundarios encontrados en las raíces son de importancia económica para la industria química y farmacéutica. Un ejemplo son los ñames que contienen moléculas básicas para la síntesis de hormonas esteroides. Otro ejemplo es la chiconina, que es producida por las raíces de la Lithospermum erithrorhizon en cultivos de raíces vellosas. La Shikonina es usada por sus propiedades antiinflamatorias, antitumorales y para curación de heridas.

Además, el crecimiento de la raíces de las plantas de cultivo mejoradas también mejora la competitividad frente a la maleza y mejora el crecimiento en áreas áridas, incrementando la accesibilidad y el consumo de agua.

El crecimiento mejorado de las raíces también es relevante para propósitos ecológicos, tales como la biorremediación y la prevención/detención de la erosión del suelo.

La arquitectura de las raíces es un área que ha permanecido durante mucho tiempo inexplorada a través de los cultivos clásicos, debido a las dificultades cuando se trata de tener acceso a este reto en el campo. Así, la biotecnología podría tener un impacto significativo en la mejora de este aspecto, puesto que no se basa en selecciones a gran escala en el campo. En cambio, las modalidades biotecnológicas requieren de un entendimiento básico de los componentes moleculares que determinan una característica específica de la planta. Hoy, este conocimiento es solamente fragmentario, y como consecuencia, la biotecnología hasta ahora ha sido incapaz de alcanzar una profunda penetración en esta área.

Un regulador bien establecido del crecimiento de las raíces es la auxina. La aplicación de ácido indol-3-acético (IAA) a las plantas en crecimiento estimula el desarrollo de las raíces laterales y la elongación de las raíces laterales (Torrey, Am J Bot 37: 257-264, 1950; Blakely et al., BotGaz 143: 341-352, 1982; Muday and Haworth, Plant Physiol Biochem 32: 193-203, 1994). Las raíces expuestas a un rango de concentraciones de IAA iniciaron números crecientes de raíces laterales (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000). Además, cuando las raíces que habían producido laterales en respuesta a una concentración particular de auxina exógena fueron expuestas subsecuentemente a concentraciones más altas de IAA, se formaron numerosas raíces laterales supernumerarias espaciadas entre las existentes (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000).

Por el contrario, el crecimiento de las raíces en agar que contenía inhibidores del transporte de la auxina, incluyendo el NPA, disminuyera el número de raíces laterales (Muday and Haworth, Plant Physiol Biochem 32: 193-203, 1994).

Se han aislado mutantes de arabidopsis que contienen niveles incrementados de IAA endogeno (Boerjan et al., Plant Cell 7: 1405-141, 1995; Celenza et al., Gene Dev 9: 2131-2142, 1995; King et al., Plant Cell 7: 2023-2037, 1995; Lehman et al., Cell 85: 183-194, 1996). Son conocidas por ser alelos de un locus localizado en el cromosoma 2. Estas cepas tienen raíces adventicias y laterales en exceso, lo que está de acuerdo con los efectos antes descritos de la aplicación externa de la auxina.

El efecto estimulador de las auxinas en la formación de raíces adventicias y laterales sugiere que la sobre producción de auxinas en las plantas transgénicas es una estrategia valida para incrementar el crecimiento de las raíces. Además, también es cuestionable si esto produciría un producto comercial con características mejoradas. A parte de su efecto estimulatorio sobre la formación de las raíces adventicias y laterales, la sobreproducción de auxina dispara otros efectos, tales como la reducción en el número de hojas, la morfología anormal de hojas (hojas estrechas, entorchadas), inflorescencias abortadas, dominio apical incrementado, formación de raíces adventicias en el tallo, la mayoría de las cuales son indeseables desde la perspectiva agronómica (Klee et al., Genes Devel 1: 86-96, 1987; Kares et al., Plant Mol Biol 15: 225-236, 1990). Por lo tanto, el principal problema con modalidades que se basan en la síntesis incrementada de la auxina es un problema de las limitaciones, a saber para confinar los efectos de la auxina sobre la raíz. Este problema no es superado probablemente por el uso de promotores específicos del tejido: las auxinas son transportadas en la planta y su acción consecuentemente no está confinada al sitio de la síntesis. Otro aspecto es si las auxinas siempre mejoraran la biomasa total de las raíces. Para plantas cultivadas sobre agar, se ha notado que las concentraciones crecientes estimulaban progresivamente la formación de raíces laterales pero inhibían concurrentemente el crecimiento de estas raíces (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000).

Los problemas anteriormente mencionados en cuanto a la limitación de los efectos de la auxina y el mantenimiento del crecimiento de las raíces se resuelven mediante las realizaciones de las reivindicaciones de la patente.

Resumen de la invención

La presente invención se relaciona con una materia objeto tal como la que se define en las reivindicaciones anexas 1 a 56.

La presente especificación describe una construcción genética que comprende un codificador genético que es una proteína con actividad de citoquinina oxidasa de la Arabidopsis thaliana. Este gen se expresa bajo el control de un promotor regulado. Este promotor puede ser regulado por factores específicos del tejido endógeno o específicos del ambiente, o alternativamente puede ser inducido por la aplicación de productos químicos...

1. Uso de un ácido nucléico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta para estimular el crecimiento radicular para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular.

2. Un método para estimular el crecimiento radicular o para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo radicular que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta seleccionada del grupo consistente de:

(a)        ácidos nucléicos que comprenden una secuencia de ADN tal como está dada por SEQ ID Nos. 3, 26 o 31, o el complemento de los mismos,

(b)        ácidos nucléicos que comprenden la secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de las SEQ ID Nos. 3, 26 o 31, o el complemento de las mismas,

(c)        ácidos nucléicos que hibridizan específicamente a cualquiera de las secuencias de las SEQ ID Nos. 3, 26 o 31 o el complemento de los mismos

(d)        ácidos nucléicos que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las SEQ ID Nos. 4 o 32, o el complemento de las mismas,

(e)        ácidos nucléicos como se define en cualquiera de (a) a (d) caracterizados porque dicho ácido nucléico es ADN, ADN genómico, ADNc, ADN o ARN sintético donde T es reemplazado por U,

(f)        un ácido nucléico que es degenerado a un ácido nucléico como el dado en cualquiera de SEQ ID Nos. 3, 26 o 31, o el cual es degenerado a un ácido nucléicos como se define en cualquiera de (a) a (e) como un resultado del código genético,

(g)        ácidos nucléicos que son divergentes de un ácido nucléico que codifica una proteína como se da en SEQ ID No. 4 o los cuales son divergentes de un ácido nucléico como se define en cualquiera de (a) a (e), debido a las diferencias en el uso de codón entre los organismos,

(h)        ácidos nucléicos que codifican una proteína como se da en SEQ ID No. 4 o ácidos nucléicos como se definen en (a) a (e) los cuales son divergentes debido a las diferencias entre alelos,

(i)        ácidos nucléicos que codifican una proteína como se da en SEQ ID No. 4,

(j)        fragmentos funcionales de ácidos nucléicos como se definen en cualquiera de (a) a (i) que tienen la actividad biológica de una citoquinina oxidasa.

3. Un ácido nucléico aislado que codifica una proteína de planta que tiene actividades citoquinina oxidasa seleccionado del grupo consistente de:

(a)        un ácido nucléico que comprende una secuencia de ADN como se da en SEQ ID No. 3, o los complementos de los mismos,

(b)        un ácido nucléico que comprende las secuencias de ARN correspondientes a SEQ ID No 3, o los complementos de las mismas,

(c)        un ácido nucléico que hibridiza específicamente a un ácido nucléico como se da en SEQ ID No. 3, o el complemento de las mismas,

(d)        un ácido nucléico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se da en SEQ ID No. 4,

(e)        un ácido nucléico que se degenera a un ácido nucléico como se da en SEQ ID No. 3 o el cual es degenerado a un ácido nucléico como se define en cualquiera de (a) a (d) como resultado del código genético,

(f)        un ácido nucléico que es divergente de un ácido nucléico que codifica una proteína como se da en SEQ ID No. 4 o el cual es divergente de un ácido nucléico como se define en cualquiera de (a) a (e) debido a las diferencias en el uso de codón entre los organismos,

(g)        un ácido nucléico que codifica una proteína como se da en SEQ ID No.4, o un ácido nucléico como se define en (a) a (e) el cual es divergente debido a las diferencias entre alelos,

(h)        un ácido nucléico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificada por un ácido nucléico como se da en SEQ ID No. 3, o un fragmento funcional de un ácido nucléico como se define en cualquiera de (a) a (g), donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa,

(i)        un ácido nucléico que codifica una proteína como se define en SEQ ID No. 4,

(j)        un ácido nucléico como se da en SEQ ID No.26,

dado que dicho ácido nucléico no es el ácido nucléico tal como se depositó en el número de acceso Genbank AC005917, y

dado que dicho ácido nucléico no es SEQ ID No. 38443 de EP 1 033 405.

4. Un ácido nucléico aislado de acuerdo con la reivindicación 3 el cual es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético, o ARN donde T está reemplazado por U.

5. Una molécula de ácido nucléico de al menos 15 nucleótidos en longitud que hibridiza específicamente con un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4.

6. Una molécula de ácido nucléico de al menos 15 nucleótidos de longitud que amplifica específicamente un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4.

7. Un vector que comprende un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4.

8. Un vector de acuerdo con la reivindicación 7 el cual es un vector de expresión donde el ácido nucléico se enlaza de manera operativa a una o más secuencias de control que permiten la expresión de dicho ácido nucléico en células huésped procariotas y/o eucariotas.

9. Una célula huésped que contiene un ácido nucléico de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 o un vector de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.

10. La célula huésped de la reivindicación 9, donde la célula huésped es una célula bacteriana, de insecto, fúngica, de planta o animal.

11. Un polipétido aislado codificable por un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4, o un derivado biológicamente activo del mismo donde dicho derivado comprende adicionalmente residuos de aminoácidos de origen natural alterados glicosilados acilados o de origen no natural y/o comprende uno o más sustituyentes no aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma presente en la naturaleza de dichos polipéptidos, o un fragmento funcional de dicho polipéptido, el cual no es SEQ ID No. 38444 de EP 1 033 405.

12. El polipétido de la reivindicación 11 el cual tiene una secuencia de aminoácidos como se da en SEQ ID No. 4, o un derivado biológicamente activo del mismo donde dicho derivado comprende adicionalmente residuos de aminoácidos alterados glicosilados, acilados o de presencia no natural y/o comprende uno o más sustituyentes no aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural de dicho polipéptido, o un fragmento funcional de dicho polipéptido.

13. Un método para producir un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 cultivando una célula huésped de la reivindicación 9 o 10 bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido y recuperar el polipéptido producido a partir del cultivo.

14. Un anticuerpo que específicamente reconoce un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 o un epítope específico del mismo.

15. Un método para la producción de plantas transgénicas, células de plantas o tejidos de plantas que comprenden la introducción de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 en un formato expresable o en un vector de la reivindicación 7 u 8 en dicha planta, célula de planta o tejido de planta.

16. Un método para la producción de plantas, células de plantas o tejidos de plantas alterados que comprende la introducción de un polipétido de la reivindicación 11 o 12 directamente en una célula, un tejido o un órgano de dicha planta.

17. Un método para efectuar la expresión de un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 que comprende la introducción de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 unido de manera operativa a una o más secuencias de control o un vector de la reivindicación 7 u 8 de manera estable en el genoma de una célula de una planta.

18. El método de la reivindicación 16 o 17 que comprende adicionalmente regenerar una planta a partir de dicha célula de planta.

19. Una célula de planta transgénica para el ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 obtenible introduciendo a una célula de planta el ácido nucléico aislado de la reivindicación 3 o 4 unido operativamente a elementos reguladores que permiten la transcripción y/o expresión de dicho ácido nucléico en células de planta, o una célula de planta transgénica obtenible por un método de la reivindicación 16 o 17.

20. La célula de planta transgénica de la reivindicación 19 donde dicho ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 está integrado de manera estable en el genoma de dicha célula de planta.

21. Una planta o un tejido de planta transgénico que comprende células de planta de la reivindicación 19 o 20.

22. Una parte recolectable de una planta de la reivindicación 21, donde dicha parte recolectable comprende células de planta de la reivindicación 19 o 20.

23. La parte recolectable de una planta de la reivindicación 22 que es seleccionada del grupo consistente de semillas, hojas, frutos, cultivos de tallo, rizomas, raíces, tubérculos y bulbos.

24. La progenie transgénica derivada de cualquiera de las plantas o partes de plantas de cualquiera de las reivindicaciones 21 o 23 que comprende células de la planta de la reivindicación 19 o 20.

25. Un método para estimular el crecimiento de la raíz que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2.

26. Un método para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2.

27. Un método para alterar el geotropismo radicular que comprende alterar la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2.

28. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, llevando dicho método a un incremento en rendimiento.

29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 donde dicha expresión de dicho ácido nucléico se presenta bajo el control de un promotor constitutivo fuerte.

30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 donde dicha expresión de dicho ácido nucleico se presenta bajo el control de un promotor que es preferencialmente expresado en raíces.

31. Un método para identificar y obtener proteínas que interactuan con un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 que comprenden una prueba de selección donde se usa un polipétido de la reivindicación 11 o 12.

32. El método de la reivindicación 31 que comprende una prueba de selección de dos híbridos donde se usan un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 como cebo y una biblioteca de ADNc como presa.

33. Un método para identificar compuestos o mezclas de compuestos que se enlazan específicamente a un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 que comprende:

(a)        combinar un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 con dicho compuesto o mezclas de compuestos bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de complejos, y

(b)        detectar la formación compleja, donde la presencia de un complejo identifica un compuesto o mezcla que enlaza específicamente dicho polipéptido.

34. Un método para el diseño de o la selección para productos químicos promotores del crecimiento o herbicidas que comprenden el uso de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucleico como se define en la reivindicación 2 o un vector de la reivindicación 7 u 8.

35. Uso de una molécula de ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucleico como se define en la reivindicación 2, el vector de la reivindicación 7 u 8, un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 para un rendimiento incrementado.

36. Uso de una molécula de ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2, el vector de la reivindicación 7 u 8, un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 para estimular el crecimiento radicular.

37. El uso de una molécula de ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2, el vector de la reivindicación 7 u 8, un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias.

38. Uso de una molécula de ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se definió en la reivindicación 2, el vector de la reivindicación 7 u 8, un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 para alterar el geotropismo radicular.

39. Composición de diagnóstico que comprende por lo menos una molécula de ácido nucléico de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, el vector de la reivindicación 7 u 8, un polipéptido de la reivindicación 11 o 12 o un anticuerpo de la reivindicación 14.

40. Un método para incrementar el tamaño del meristema radicular que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en raíces.

41. Un método para incrementar el tamaño de la raíz que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en raíces.

42. Un método para incrementar el tamaño del meristema radicular que comprende la regulación en descenso de la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2, preferiblemente en brotes.

43. Un método para retrasar la senescencia de las hojas que comprende la regulación en descenso de la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en hojas, preferiblemente en hojas senescentes.

44. Un método para alterar la senescencia de las hojas que comprende la expresión de un ácido nucleico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en hojas senescentes.

45. Un método para incrementar el espesor de las hojas que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas.

46. Un método para reducir el tamaño de vaso que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de la planta.

47. Un método para incrementar el tamaño de los vasos que comprende la regulación descendente de la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas.

48. Un método para inducir la partenocarpia que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en la placenta, óvulos y tejidos derivados de los mismos.

49. Un método para mejorar la permanencia de siembras que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en siembras, preferiblemente en las raíces de las siembras.

50. Un método para incrementar la ramificación que comprende la expresión en ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas.

51. Un método para mejorar la resistencia al alojamiento que comprende la expresión de un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en plantas o partes de plantas, preferiblemente en tallos o nódulos axilares.

52. Uso de una raíz de reserva transgénica que comprende un ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2 en procedimientos de injerto con un scion para mejorar las características relacionadas con la raíz de la planta o árbol resultante caracterizado por un crecimiento potenciado de la raíz debido a la expresión de una citoquinina oxidasa de la planta codificada por dicho ácido nucléico en dicha raíz de reserva.

53. Una planta transgénica que comprende una raíz de reserva transgénica que expresa una citoquinina oxidasa de planta de acuerdo con la reivindicación 52 y comprende adicionalmente un sción.

54. Una parte recolectable de una planta de la reivindicación 53, donde dicha parte recolectable comprende el ácido nucléico de la reivindicación 3 o 4 o un ácido nucléico como se define en la reivindicación 2.

55. Un método para estimular el crecimiento y desarrollo radicular que comprende la expresión de un ácido nucléico que codifica una citoquinina oxidasa de planta en una célula o cultivo de tejidos de una planta transgénica.

56. Un método de acuerdo con la reivindicación 55 donde dicho ácido nucléico es por lo menos uno de los ácidos nucléicos de la reivindicación 3 o como se define en la reivindicación 2.