METODO PARA INCREMENTAR LA RESISTENCIA FRENTE A FACTORES DE ESTRES EN LOS VEGETALES.

Método para la generación o incremento de la resistencia frente a al menos un factor de estrés biótico en plantas en el cual están comprendidos los siguientes pasos de trabajo:

a) Incremento de la cantidad de proteína de al menos una proteína de inhibidor de Bax -1 (BI1) en al menos un tejido vegetal de la planta con la condición de que la expresión en la epidermis de la hoja permanezca esencialmente sin modificar o que se reduzca, y

b) Selección de las plantas en las que en comparación con la planta de partida ya exista una resistencia contra al menos un factor de estrés biótico o se incremente; y en donde el factor de estrés es un patógeno de la planta

Método para incrementar la resistencia frente a factores de estrés en los vegetales.

La invención se refiere a métodos para generar o incrementar la resistencia frente a, al menos, un factor de estrés biótico o abiótico en los vegetales, preferiblemente frente a plantas patógenas, mediante el incremento de la expresión de, al menos, una proteína inhibidora Bax 1 (BI1) en al menos un tejido vegetal, con la condición de que la expresión en la epidermis de la hoja permanece esencialmente inmodificada.

Un objetivo de los trabajos biotecnológicos en vegetales es la producción de vegetales con propiedades novedosas y ventajosas, por ejemplo para el incremento de la productividad agrícola, para el incremento de la calidad en los productos alimenticios o para la producción de determinados productos químicos o farmacéuticos. Con frecuencia son insuficientes los mecanismos de defensa naturales del vegetal frente a patógenos. Las solas enfermedades por hongos conducen a pérdidas anuales en cosechas de muchos millardos de UStextdollar. La introducción de genes ajenos a partir de fuentes vegetales, animales o microbianas puede incrementar las defensas. Ejemplos son la protección de tabaco frente al daño por comida de insectos mediante expresión de endotoxinas de Bacillus thuringiensis (Vaeck et al. (1987) Nature 328:33-37) o la protección del tabaco frente a la infestación de hongos mediante expresión de una quitinasa de frijol (Broglie et al. (1991) Science 254:1194-1197). Sin embargo, la mayoría de los planteamientos descritos solo ofrecen resistencia a un patógeno individual o a un espectro estrecho de patógenos.

Existen solo unos pocos planteamientos que confieren resistencia a los vegetales frente a un espectro más amplio de patógenos, en particular frente a hongos patógenos. La resistencia sistémica adquirida ("systemic acquired resistance"; SAR) - un mecanismo de defensa en una variedad de interacciones de vegetal/patógeno - puede conferirse mediante aplicación de sustancias mensajeras endógenas, tales como ácido jasmónico (JA) o ácido salicílico (SA) (Ward et al. (1991) Plant Cell 3:1085-1094; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4(6):645-656). Efectos similares también pueden alcanzarse mediante compuestos sintéticos tales como ácido 2,6-dicloroisonicotínico (DCINA) o éster S-metílico de ácido benzo(1,2,3)tiadiazol-7-tiocarboxílico (BTH; Bion®) (Friedrich et al. (1996) Plant J 10(1):61-70; Lawton et al. (1996) Plant J 10:71-82). La expresión de las proteínas relacionadas con patogénesis ("pathogenesis related" (PR)), que están altamente reguladas en el caso de SAR, también puede provocar parcialmente resistencia patógena.

En cebada, el locus Mlo se describe como un regulador negativo de defensa patógena. La pérdida o la pérdida de función ("loss-of-function") del gene Mlo ocasiona una resistencia aumentada resistencia no específica con respecto a la raza frente a un gran número de aislados de mildiu (Büschges R et al. (1997) Cell 88:695-705; Jorgensen JH (1977) Euphytica 26:55-62; Lyngkjaer MF et al. (1995) Plant Pathol 44:786-790). El gen de Mlo está descrito (Büschges R et al. (1997) Cell 88:695-705; WO 98/04586; Schulze-Lefert P, Vogel J (2000) Trends Plant Sci. 5:343-348). Se aislaron diversos homólogos de Mlo de otras especies de cereales. Se han descrito métodos usando estos genes para lograr una resistencia patógena (WO.98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552). La desventaja es que las plantas con deficiencia de Mlo también inician los mecanismos de defensa arriba mencionados en ausencia de un patógeno que se manifiesta en una mortandad espontánea de células de la hoja. (Weiter M et al. (1993) Mol Gen Genet 239:122-128). Por esto las plantas resistentes a mlo sufren un menoscabo de rendimiento de alrededor de 5% (Jörgensen JH (1992) Euphytica 63: 141-152). La muerta espontánea de las células de hoja implica además una hiper-susceptibilidad desventajosa frente a patógenos necrotrofos y hemibiotrofos tales como Magnaporte grisea (M. grisea) o Cochliobolus sativus (Bipolaris sorokiniana) (Jarosch B et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:508-514; Kumar J et al. (2001) Phytopathology 91: 127-133).

Los factores que inducen un efecto comparable de resistencia mlo frente a hongos necrotrofos, no han podido identificarse hasta ahora. La razón para esto puede ser el mecanismo de infección específico de los hongos necrotrofos: en lugar de una penetración facilitada por appressoria, primero liberan micotoxinas y enzimas dentro de las células huésped de la planta, lo cual conduce a la muerte de la célula. Sólo entonces la célula es penetrada (Shirasu K and Schulze-Lefert P (2000) Plant Mol Biol 44:371-385). Estrategias similares de infección se emplean por patógenos bacterianos tales como Erwinina carotovora (Whitehead NA et al. (2002) Antonie van Leeuwenhoek 81: 223-231). Una resistencia a la penetración con la ayuda de la formación de papilas no representa una estrategia eficiente de defensa.

La apoptosis, también denominada muerte celular programada, es un mecanismo esencial para mantener la homeostasis de tejido y, de esta manera, constituye un mecanismo negativamente regulador que contrarresta la división celular. En organismos multicelulares, la apoptosis es una parte natural de la ontogénesis e involucra, entre otros, el desarrollo de los órganos y la remoción de células envejecidas, infectadas o mutadas. La apoptosis permite que tenga lugar una eliminación eficiente de células indeseadas. Una interferencia o inhibición de la apoptosis contribuye a la patogénesis de un rango de enfermedades, entre otras de la carcinogénesis. Los efectores principales de la apoptosis son proteasas de cisteína específicas a aspartato, las llamadas caspasas. Estas pueden activarse por medio de, al menos, dos rutas de señales de apoptosis: primero, la activación de la familia receptora de TNF (Tumor Necrosis Factor); segundo, el papel central desempeñado por las micondrias. La activación de las rutas de señal apoptótica de las mitocondria está regulada por proteínas de la familia Bcl-2. Esta familia de proteínas consiste en proteínas anti-apoptóticas y pro-apoptóticas tales como, por ejemplo, Bax. En el caso de un estímulo apoptótico, tiene lugar un cambio conformacional alostérico de la proteína Bax sufre el cual conduce a un anclaje de la proteína en la membrana externa de la mitocondria y a su oligomerización. El resultado de estos oligómeros es que se liberan moléculas pro-apoptóticas desde la mitocondria hacia el zitosol y estas moléculas ocasionan una cascada de señal apoptóticas y, finalmente, la degradación de sustratos celulares específicos, lo cual tiene la muerte celular como consecuencia. El inhibidor Bax 1 BI1 se aisló por su propiedad de inhibir el efecto proapoptótico de BAX (Xu Q & Reed JC (1998) Mol Cell 1(3): 337-346). BI1 representa una proteína altamente conservada. Se encuentra predominantemente como componente integral de membranas intracelulares. BI1 interactúa con bcl-2 y bcl-x1. La sobreexpresión de BI1 en células de mamíferos suprime el efecto proapoptótico de BAX, etoposido y staurosporina, pero no de antígeno Fas (Roth W and Reed JC (2002) Nat Med 8: 216-218). La inhibición de BI1 por ARN antisense, por el contrario induce apoptosis (Xu Q & Reed JC (1998) Mol Cell 1(3):337-346). Los primeros homólogos vegetales de BI1 han sido aislados de arroz y Arabidopsis (Kawai et al. (1999) FEBS Lett 464:143-147; Sanchez et al (2000) Plant J 21:393-399). Estas proteínas vegetales suprimen la muerte celular inducida por BAX en levadura. La homología de secuencia de aminoácido con BI1 es de cerca del 45%. El homólogo de Arabidopsis AtBI1 es capaz de suprimir, en vegetales recombinantes, el efecto pro-apoptótico de BAX de ratón (Kawai-Yamada et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(21):12295-12300). El homólogo BI1 de arroz (Oryza sativa) se expresa en todos los tejidos vegetales (Kawai et al. (1999) FEBS Lett 464: 143-147). Además, se encuentran descritos genes BI1 de cebada (Hordeum vulgare; GenBank Acc.-No.: AJ290421), arroz (GenBank Acc.-No.: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc.-No.: AB025927), tabaco (GenBank Acc.-No.: AF390556) y colza (GenBank Acc.-No.: AF390555, Bolduc N et al. (2003) Planta 216:377-386). La expresión de BI1 en cebada en altamente regulada como consecuencia de una infección con mildiu (Hückelhoven R et al. (2001) Plant Mol Biol 47(6):739-748). WO 00/26391 describe la sobreexpresión de los genes antiapoptóticos Ced-9 de C. elegans, sfIAP de Spodoptera frugiperda, bcl-2...

1. Método para la generación o incremento de la resistencia frente a al menos un factor de estrés biótico en plantas en el cual están comprendidos los siguientes pasos de trabajo:

a) Incremento de la cantidad de proteína de al menos una proteína de inhibidor de Bax -1 (BI1) en al menos un tejido vegetal de la planta con la condición de que la expresión en la epidermis de la hoja permanezca esencialmente sin modificar o que se reduzca, y

b) Selección de las plantas en las que en comparación con la planta de partida ya exista una resistencia contra al menos un factor de estrés biótico o se incremente; y

en donde el factor de estrés es un patógeno de la planta.

2. Método según la reivindicación 1 donde el factor de estrés es un patógeno necrotrófico o hemibiotrófico.

3. Método según una de las reivindicaciones 1 a 2, donde la proteína BI-1 comprende al menos una secuencia que presenta una homología de al menos 50% con al menos un motivo de consenso BI1 seleccionado del grupo que se compone de

a) H (L/I) KXVY,

b) AXGA (Y/F) XH,

c) NIGG,

d) P (V/P) (Y/F) E (E/Q) (R/Q) KR,

e) (E/Q) G (A/S) S (V/I) GPL,

f) DP(S/G)(L/I)(I/L),

g) V (G/A) T (A/S) (L/I) AF (A/G) CF (S/T),

h) IL (Y/F) LGG,

i) L (L/V) SS (G/W) L (S/T) (I/M) L (L/M) W, y

j) DTGX(I/V) (I/V)E.

4. Método según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína BI1 se codifica por un polipéptido que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que se compone de:

a) las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 38, y

b) secuencias que presentan una identidad de al menos 50% con una de las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 38,

c) secuencias que comprenden al menos una secuencia parcial de al menos 10 residuos de aminoácidos relacionados de una de las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 38.

5. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el incremento de la cantidad de proteína de al menos una proteína BI1s mediante expresión recombinante de la dicha proteína BI1 se realiza bajo control de un promotor específico para raíz, tubérculo o mesófilo.

6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende

(a) transformación estable de una célula de la planta con un casete recombinante de expresión que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI en conexión funcional con un promotor específico de tejido, donde el promotor no presenta esencialmente actividad en la epidermis de la hoja y donde el promotor es heterólogo con respecto a la dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI,

(b) Regeneración de la planta a partir de la célula de la planta, y

(c) Expresión de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI en una cantidad y durante un tiempo que sean suficientes para generar o elevar una resistencia a patógenos en dicha planta.

7. Método según una de las reivindicaciones 1 a 6, donde la planta se selecciona de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas.

8. Método según una de las reivindicaciones 1 a 7, donde la planta se selecciona del grupo de las plantas monocotiledóneas que se compone de trigo, avena, mijo, cebada, centeno, maíz, arroz, alforfón, trigo, triticale, escanda, lino o caña de azúcar.

9. Método según una de las reivindicaciones 1 a 8, donde la expresión del inhibidor de Bax -1 (BI-1) se eleva en el mesófilo.

10. Método según una de las reivindicaciones 1 a 9, donde la planta presenta un fenotipo resistente a mlo o inhibe la expresión o función de MLO, RacB y/o NaOx al menos en la epidermis o se reduce en comparación con una planta de control y/o se incrementa la expresión o función de PEN2, SNAP34 y/o PEN1 al menos en la epidermis en comparación con una planta de control.