Método para incrementar la efectividad de cepas bacterianas. Se describe un método para incrementar la patogenicidad de cepas bacterianas del género Bacillus que comprende exponer la cepa a temperaturas inferiores a la temperatura ambiental u otras situaciones de estrés,

una composición de cepas bacterianas obtenidas por dicho método, y el uso de dicha composición en el control biológico de la plaga de Ceratitis capitata

Método para incrementar la efectividad de cepas bacterianas.

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular y biotecnología, específicamente a un método para incrementar la efectividad de cepas bacterianas en el control biológico de plagas, al someterlas a condiciones de estrés. Además se refiere a una composición que incluya estas cepas bacterianas, a las cepas bacterianas en concreto y a sus usos.

Antecedentes de la invención

Las poblaciones de todos los organismos vivos son, en alguna medida, reducidas por la acción natural de sus depredadores, parásitos, antagonistas y patógenos. Este proceso ha sido llamado "control natural"; sin embargo, cuando la densidad de las poblaciones de plagas es manipulada por el hombre se denomina control biológico, y los agentes que llevan a cabo el control son llamados enemigos naturales. Así, los humanos pueden explotar el control biológico de varias maneras para suprimir las poblaciones de las plagas.

El control biológico se define como el uso de organismos vivos para suprimir la población de una plaga específica, haciéndola menos abundante o menos perjudicial de lo que de otra manera podría ser.

El inicio del control biológico data del año 324 DC, cuando en la China cultivaban la hormiga Oecophylla smaragdina para proteger los campos de cítricos de las potenciales plagas de coleópteros y lepidópteros; no obstante, el desarrollo y crecimiento del control biológico se produjo en la época en que la aplicación de plaguicidas químicos sintéticos era el método dominante de control de plagas, y aparecieron problemas de especificidad con su uso. Entre las razones para usar plaguicidas biológicos están los efectos secundarios negativos en la salud humana y en la preservación ambiental que causan los plaguicidas químicos, la ausencia de residualidad y su alta especificidad, especialmente en comparación con plaguicidas químicos. Entre otras, las principales ventajas del uso de plaguicidas biológicos son las siguientes:

Las bacterias entomopatógenas del género Bacillus son potenciales agentes naturales de control biológico de insectos, constituyendo la base de varios bioinsecticidas comerciales, que en el caso de algunas plagas han resultado altamente efectivos y específicos. En control biológico de plagas las especies de Bacillus más importantes son las patógenos de insectos B. thuringiensis, que forma un cuerpo paraesporal tóxico para insectos, B. sphaericus, B. larvae, B. lentimorbis, y B. popilliae que son patógenos invasivos. B. pumilus, que a pesar de no ser considerada una especie entomopatógena clásica, posee características potenciales para serlo (US6001637). Las bacterias del género Bacillus producen toxinas que son diferentes entre especies, y han sido usadas como caracteres diagnósticos para poder clasificarlas (v.g. B. cereus de B. pumilus); estas toxinas lisan eritrocitos de diferentes especies de animales (hemolisinas), atacan proteínas (actividad proteolítica), degradan lecitinas por acción de lecitinasas, tienen propiedades insecticidas, etc. Hasta el momento no se ha descrito ninguna cepa bacteriana del género Bacillus que pueda ser utilizada como bioinsecticida frente a Ceratitis capitata.

Cualquier bacteria regula su expresión génica en respuesta a diferentes señales medioambientales, una propiedad esencial para competir con otros organismos. En el caso particular de bacterias patógenas, la regulación génica crucial para permitir la supervivencia de la bacteria al particular ambiente que le ofrece su hospedador. Los genes de virulencia bacterianos están sujetos a complejos mecanismos de regulación para asegurar la expresión del gen apropiado en el momento apropiado.

La expresión de los genes de virulencia en bacterias es un fenómeno que se encuentra afectado por una gran variedad de parámetros, generalmente físicos y químicos, entre los que se encuentran la temperatura, osmolaridad, pH, tensión de O₂ y CO₂, concentración de iones, niveles de hierro, tasa de crecimiento y densidad de población.

Existen numerosos estudios referentes al aumento de la virulencia de las bacterias en condiciones de estrés, bien por la inhibición de la expresión de ciertos genes o por sobre expresión de los mismos. En concreto, las bacterias patógenas sobreviven bajo dos condiciones completamente distintas, esto es, su ambiente natural y su hospedador. Los determinantes de la virulencia de las bacterias patógenas se encuentran bajo el control de activadores transcripcionales que responden a variaciones de temperatura, osmolaridad, concentración de iones metálicos y tensión de oxigeno en el medio ambiente. La regulación de los genes inducidos por el estrés puede ocurrir a nivel de la transcripción, o la traducción, o por modificaciones post-transduccionales. También, bajo ciertas condiciones de estrés, cambios locales en la superhélice de ADN pueden inducir o reprimir la expresión de genes. Las bacterias patógenas han desarrollado un mecanismo altamente sofisticado para captar las condiciones externas y ajustar su expresión genética convenientemente, activando el conjunto de genes cuyos productos ayudan a su supervivencia, y desechando aquellos productos que no son necesarios en un medioambiente particular. La activación de este sensor permite a la bacteria monitorizar los parámetros medioambientales que permiten distinguir entre el medio exterior y el hospedador, y ajustar su expresión genética convenientemente, particularmente mediante la inducción de factores de virulencia. (Albright et al 1989. Prokaryotic signal transduction mediated by sensor and regulator protein pairs; Annu. Rev. Genet. 23 311336; Parkinson and Kofoid 1992. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26 71112). Condiciones de estrés como cambios en la osmolaridad en el medio de crecimiento, anaerobiosis, cambios de temperatura y pH que experimenta la bacteria cuando penetra en el hospedador, pueden controlar la expresión genética induciendo cambios en la topología del ADN (Dorman 1991. DNA supercoiling and environmental regulation of gene expression in pathogenic bacteria; Infect. Immun. 59 745-749).

La temperatura es un factor fundamental en la expresión de ciertos genes. Así, se han detectado diferentes niveles de expresión en bacterias creciendo a distintas temperaturas. Por ejemplo, en Listeria monocytogenes se han detectado diferentes niveles de expresión en diversos genes (implicados en la respuesta adaptativa al frío, respuesta general al estrés, metabolismo de los aminoácidos, alteraciones en la superficie celular y metabolismo degradativo) cuando crece a 10ºC frente a los 37ºC estándar.

Por tanto, la temperatura es uno de los factores fundamentales que provocan estrés, estimulando principalmente dos fenómenos:

a) Inducción de los genes de virulencia

En general, la primera sensación que experimenta una bacteria cuando penetra en un hospedador es un aumento de temperatura. Así, en bacterias patógenas humanas, como Salmonellae, Shigellae, Yersinae, Bordetella pertusis (Maurelli 1989. Temperature regulation of virulence genes in pathogenic bacteria: a general strategy for human pathogens?; Microb. Pathog. 7 1-10), Borrelia burgdorferi (Cluss and Boothby 1990. Thermoregulation of protein synthesis in Borrelia burgdorferi; Infect. Immun. 58 1038-1042), Listeria monocytogens, los casetes de los genes de virulencia se activan a 37ºC, y se encuentran bajo el control de activadores transcripcionales, como, por ejemplo, PrfA (Wachter et al 1992. The expression of virulence genes in Listeria monocytogenes is thermoregulated; J. BacterioL 174 947-952), lcrF en Yersinia pestis y virF en Shigella flexineri...

1. Método para incrementar la patogenicidad de cepas bacterianas del género Bacillus que comprende exponer la cepa a temperaturas inferiores a 25ºC.

2. Método según la reivindicación 1, donde la exposición se realiza a temperaturas inferiores a 20ºC.

3. Método según la reivindicación 2, donde la exposición se realiza a temperaturas inferiores a 15ºC.

4. Método según la reivindicación 3, donde la exposición se realiza a temperaturas inferiores a 10ºC.

5. Método según la reivindicación 4, donde la exposición se realiza a temperaturas iguales o inferiores a aproximadamente 4ºC.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde las cepas bacterianas se cultivan en un medio con un pH igual o menor a 5.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde las cepas bacterianas se cultivan en un medio con un pH de entre 2 y 4.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde las cepas bacterianas se cultivan en un medio con una concentración de solutos igual o mayor a 250 mM.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde las cepas bacterianas se cultivan en un medio con una concentración de solutos de entre 350 mM y 1000 mM.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde las cepas bacterianas pertenecen a la especie B. pumilus.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde las cepas bacterianas pertenecen a la especie B. thuringiensis.

12. Cepas bacterianas del género Bacillus obtenibles por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

13. Composición que comprende cepas bacterianas según la reivindicación 12.

14. Uso de las cepas bacterianas según la reivindicación 12, o de la composición según la reivindicación 13, para el control biológico de plagas.

15. Uso de las cepas bacterianas o de la composición según la reivindicación 14, donde la plaga controlada es provocada por la mosca del Mediterráneo (Ceratitis capitata).

16. Uso de cepas bacterianas de la especie Bacillus pumilus, para el control biológico la plaga de Ceratitis capitata.

17. Uso de cepas bacterianas de la especie Bacillus thuringensis, para el control biológico de la plaga de Ceratitis capitata.

18. Uso de cepas bacterianas del género Bacillus con al menos un 95% de identidad con la región 16S del ARN de Bacillus pumilus, o un 95% de identidad con la región 16S del ARN de Bacillus thuringensis, para el control biológico de la plaga de Ceratitis capitata.