METODO PARA DETECTAR RIESGO DE INFERTILIDAD MASCULINA.
Método para detectar riesgo de infertilidad masculina.
La presente invención se refiere a un método in vitro para detectar riesgo de sufrir infertilidad masculina,
que comprende la identificación de la presencia del polimorfismo de un único nucleótido -190C>A del promotor del gen de la protamina 1 en una muestra de un varón humano, y que además comprende la identificación de la presencia de otros SNPs del grupo: otros SNPs del gen de la protamina 1, SNPs del gen de la protamina 2, SNPs del gen C16orf75 SNPs, y/o SNPs del gen LOC388210
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200800697.
Solicitante: UNIVERSIDAD DE BARCELONA.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: BARCELONA.
Inventor/es: OLIVA VIRGILI,RAFAEL, ORIOLA AMBROS,JOSEP, GAZQUEZ BAYLO,CRISTINA, BALLESCA LAGARDA,JOSE LUIS.
Fecha de Solicitud: 5 de Marzo de 2008.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 22 de Junio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68M6
Clasificación PCT:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Fragmento de la descripción:
Método para detectar riesgo de infertilidad masculina.
La presente invención se refiere los campos de ingeniería genética y biotecnología. La invención se refiere especialmente a un método para detectar riesgo de sufrir infertilidad masculina mediante el uso de un marcador tipo polimorfismo de un único nucleótido ("single nucleotide polymorphism", SNP).
Estado de la técnica
Las protaminas son las proteínas más abundantes presentes en el núcleo del espermatozoide de muchas especies diferentes (Eirin-López, JM et al, (2006) J. Biol. Chem. 281, 1-4). Diferentes estudios han demostrado la presencia de una expresión alterada de protaminas en algunos pacientes infértiles (Aoki, VW et al., (2006) J. Androl. 27, 890-8). Tan pronto como se identificaron estas diferencias en el contenido de protamina se postuló la posible existencia de mutaciones en los genes correspondientes (De Yebra, L. et al., (1993) J. Biol. Chem. 268, 10553-7). Sin embargo el análisis mutacional inicial en los genes protamina sugirió que la presencia de mutaciones patogénicas en estos genes era una causa poco frecuente de infertilidad (De Yebra, L. et al. Supra; Aoki, VW et al., (2006) Fertil. Steril. 86, 1416-22). Posteriormente se demostró en ratones que una haploinsuficiencia en las protaminas o proteínas de transición resultaba en infertilidad, alteraciones en el empaquetamiento de la cromatina, daño en el DNA y en una alteración de la morfología de los espermatozoides (Cho, C. et al., (2001) Nat. Genet. 28, 82-6 y Suganuma, R. et al., (2005) Hum. Reprod. 20, 3101-8).
Algunos de los documentos que tienen relación con la presente invención se comentan a continuación:
EP1484399 se refiere a diferentes genes que están implicados en la infertilidad masculina (ver Tabla 2 y Fig. 2 donde se puede observar algunas mutaciones puntuales situadas en el gen de la protamina 1). Se describe el análisis de SNPs situados en el gen de la protamina 1 (véase el párrafo 0157 en la página 25 y Tabla 6 en la página 26 de EP1484399). EP1484399 y Tanaka et al 2003 Mol. Hum. Reprod. 9, 69-73, se refieren a polimorfismos ubicados en las regiones codificante o 5'UTR del gen de la protamina 1. Los polimorfismos 133A>G, 160C>A, 320G>A, y 321 C>A, están ubicados en la región codificante del gen de la protamina 1 y el polimorfismo 431A>C está en la región 5'UTR. La frecuencia (%) en los pacientes de los seis polimorfismos mencionados con anterioridad es, respectivamente, 3.1, 0.0, 0.4, 34.5, 8.9 y 0.4. No existe ninguna relación estadísticamente significativa entre los polimorfismos 133A>G, 160C>A, 320G>A y 431A>C y la infertilidad masculina. Además estos polimorfismos son muy poco frecuentes en los pacientes de tal forma que no resultan útiles para el diagnóstico de la mayoría de los casos de infertilidad masculina. No existe ninguna relación estadísticamente significativa entre los polimorfismos 321C>A y la infertilidad masculina.
Aoki, VW et al., (2006) J. Androl. 27, 890-8, hace referencia a un estudio de los SNPs situados en las regiones 5' y 3'UTR de los genes de la protamina 1 y de la protamina 2. El objetivo de este estudio fue determinar si SNPs en las regiones 5' y 3' no traducidas (UTR) de los genes de la protamina humana 1 y 2 están relacionados anomalías de expresión de las protaminas. Este estudio identificó 14 SNPs en estas regiones no traducidas de los genes de la protamina 1 y 2, pero este documento sólo especifica, como interesante el cambio G/C en posición 62 pb en la región 3'UTR protamina 2. Este documento señala que dicho SNP no se encontró en ninguno de los hombres seleccionados que tenían una relación de protaminas normal, pero no especifica si existe una relación estadística significativa entre dicho cambio G/C y la infertilidad masculina. Por otra parte, aunque no se ha hecho un estudio estadístico en ese documento, los resultados sugieren que este polimorfismo puede ser responsable de la infertilidad masculina sólo en el 4% de los pacientes.
En Tanaka, H. et al (2003) Mol. Hum. Reprod. 9, 69-73, se han identificado cuatro SNPs situados en la región codificante y otro SNP ubicado en la región 3' no codificante del gen de la protamina 1 (ver Fig. 1 y Tabla 1). Además se han identificado otros SNPs localizados en el gen de la protamina 2. La influencia de estos SNPs en la infertilidad masculina se discute en este trabajo.
Iguchi N. et al (2006), J. Med. Genet. 43, 382-4 se refiere a la influencia de la cantidad y cambios en la estructura de los genes de la protamina en la infertilidad masculina. Se secuenció el gen de la protamina 1 en hombres infértiles y se identificó el SNP 197G>T, situado en la región codificante del gen de la protamina 1, a través de la técnica de RFLPs (fragmentos de restricción de longitud polimórfica). No se ha hecho un estudio estadístico en este documento, pero los resultados sugieren que este polimorfismo puede ser responsable de la infertilidad masculina sólo en 3 de 30 (10%) de los casos analizados.
Aoki, VW et al (2006) Fertil. Steril. 86, 1416-22 se refiere a un estudio donde se han identificado varios SNPs situados en las regiones codificantes de los genes de la protamina 1 y 2. Especialmente se han identificado tres SNPs en la región codificante del gen de la protamina 1 (ver Tabla 2), y dos de ellos se describen por primera vez en este artículo (54G>A y 102G>T). No existe ninguna relación estadísticamente significativa entre los polimorfismos 54G>A o 102G>T y la infertilidad masculina. Estos dos polimorfismos son muy poco frecuentes en los pacientes varones infértiles, y cuando se compara la frecuencia en los pacientes con el grupo de control se puede ver que la frecuencia es muy similar, por lo que estos dos polimorfismos no son útiles para diagnosticar la infertilidad masculina. En 230C>A la frecuencia es superior a la frecuencia de los polimorfismos de los otros dos, pero también similar en los pacientes y en el grupo control, por lo que este polimorfismo tampoco resulta útil para diagnosticar la infertilidad masculina.
La propuesta de que mutaciones genéticas en el gen de la protamina podrían estar involucradas en la infertilidad tiene su origen en la detección de diferencias en el contenido de protaminas en los espermatozoides de pacientes infértiles (De Yebra, L., supra). Esta idea fue apoyada, además, por el hecho de que la falta de protamina P2 en el núcleo de los espermatozoides de algunos mamíferos como el cerdo o el toro se debía a la presencia de mutaciones en los genes correspondientes (Maier, WM, et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18, 1249-54). Sin embargo el análisis inicial de mutaciones en los genes de la protaminas P1, P2 o proteína 1 de la transición no revelaron ninguna mutación patogénica (Schlicker, M. et al., (1994) Hum. Reprod. 9, 2313-7). En un estudio posterior, se postuló un papel de una mutación detectada en la región de contacto en la matriz nuclear ubicada cerca de los genes de la protamina en 2 de 5 personas analizadas (Kramer, JA et al., (1997) Genet. Test. 1, 125-9). Más recientemente se han caracterizado mutaciones en los genes de la protamina P1 (PRM1) y de la protamina P2 (PRM2) en 226 pacientes japoneses estériles y en 270 controles (Tanaka, H. et al. supra). En este caso, se encontraron sólo 4 únicos polimorfismos (SNPs) en la región codificante del gen P1, y un SNP (248C>T) en el gen P2 creando un codón de stop prematuro. También en este trabajo se identificó un SNP en la región 3' del gen P1 gen y 2 SNPs en el intrón del gen P2. Se han descrito varios polimorfismos no patogénicos en la región codificante en pacientes infértiles (Aoki, V. et al., (2006) Fertil. Steril. supra). Recientemente se ha detectado un SNP (197G>T) que daba lugar a un cambio de arginina a serina en el gen de la protamina 1, en 3 de treinta pacientes infértiles (Iguchi, N. et al. Supra). Es interesante observar que estos pacientes fueron seleccionados sobre la base de un fenotipo de espermatozoide similar al presente en ratones knock-out de los genes de la protamina P1 o P2. Sin embargo, en trabajos anteriores, los inventores del presente trabajo fueron incapaces de detectar la mutación 197G>T en ninguno de los 32 pacientes infértiles con menos de 9% de las formas normales en sus espermatozoides, inicialmente estudiadas a través de secuenciación directa. Por lo tanto, en base a lo anterior se puede concluir que las mutaciones de la región codificante del gen PRM1 son una causa poco frecuente de infertilidad.
Reivindicaciones:
1. Método in vitro para detectar riesgo de sufrir infertilidad masculina, que comprende la identificación de la presencia del polimorfismo de un único nucleótido -190C>A del promotor del gen de la protamina 1 en una muestra de un varón humano, donde la presencia del polimorfismo está asociada con un riesgo de sufrir infertilidad.
2. Método según la reivindicación 1, que comprende además la identificación de la presencia de otros polimorfismos de un único nucleótido del gen de la protamina 1.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende además la identificación de la presencia de polimorfismos de un único nucleótido del gen de la protamina 2.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además la identificación de la presencia de polimorfismos de un único nucleótido del gen C16orf75.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además la identificación de la presencia de otros polimorfismos de un único nucleótido del gen LOC388210.
6. Método según cualquiera de los reivindicaciones 1-5, donde la identificación de la presencia del polimorfismo -190C>A se lleva a cabo mediante secuenciación de un fragmento que comprenda el promotor del gen de la protamina 1, ya sea por la técnica de fragmentos de restricción de longitud polimórfica o por hibridación a una sonda.
7. Método según la reivindicación 6, donde la identificación de la presencia del polimorfismo -190C>A se lleva a cabo mediante secuenciación de un fragmento que comprenda el promotor del gen de la protamina 1 y la determinación del nucleótido presente en la posición -190 del gen.
8. Método según la reivindicación 7, donde la secuenciación comprende la utilización de un sistema de secuenciación acoplado a electroforesis capilar o acoplado a la amplificación por PCR y detección de PPi liberado por acoplamiento a luciferasa.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, donde el fragmento secuenciado del gen de la protamina 1 es amplificado por PCR.
10. Método según la reivindicación 9, donde el cebador sentido es de SEQ ID NO: 1.
11. Método según la reivindicación 10, donde el cebador antisentido es de SEQ ID NO: 2.
12. Método según la reivindicación 6, donde la identificación de la presencia del polimorfismo -190C>A se lleva a cabo mediante la aplicación de la técnica de fragmentos de restricción de longitud polimórfica.
13. Método según la reivindicación 12, donde los fragmentos de restricción son obtenidos por digestión con HaeIII.
14. Método según la reivindicación 13, donde el fragmento de restricción es un fragmento de ADN que contiene el nucleótido correspondiente al polimorfismo -190C>A, donde dicho fragmento de ADN ha sido obtenido mediante amplificación por PCR con un cebador adyacente al sitio polimórfico -190 que suprime el sitio HaeIII interno correspondiente a la posición -183 del gen de la protamina 1.
15. Método según la reivindicación 14, donde el cebador adyacente al sitio polimórfico -190 es el cebador de SEQ ID NO: 3 y la aparición de un fragmento de 67 pb indica la presencia del polimorfismo -190C>A.
16. Método según la reivindicación 6, donde la identificación de la presencia del polimorfismo -190C>A se lleva a cabo por la hibridación de una muestra que comprende el promotor del gen de la protamina 1 a una sonda complementaria.
17. Método según la reivindicación 16, donde la hibridación se acopla a otras técnicas seleccionadas del grupo que consiste en PCR a tiempo real y detección de la sonda por FRET; PCR a tiempo real y evaluación de la fuerza de interacción entre la sonda y la muestra de ADN mediante análisis de la curva de fusión de la sonda; primer extensión y electroforesis capilar; extensión de un solo nucleótido previo a la hibridación; pirofosforolisis de sondas perfectamente hibridadas, y detección de la liberación de PPi por acoplamiento a luciferasa.
18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16-17, donde la sonda es parte de un multiarray de sondas correspondientes a diferentes polimorfismos.
19. Kit para llevar a cabo el método in vitro tal como se define en la reivindicación 1, que comprende medios para la identificación del polimorfismo -190C>A en una muestra.
20. Kit según la reivindicación 19, donde los medios comprenden cebadores adecuados para llevar a cabo la secuenciación de un fragmento que comprende la posición -190.
21. Kit según la reivindicación 20, donde el cebador es de SEQ ID NO: 1.
22. Kit según la reivindicación 20, donde un cebador es de SEQ ID NO: 2.
23. Kit según la reivindicación 19, donde un cebador es de SEQ ID NO: 3.
24. Kit según la reivindicación 19, donde los medios comprenden sondas complementarias a un fragmento que comprende la posición -190 del gen.
25. Uso de un kit tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 19- 24, para la identificación de la presencia del polimorfismo -190C>A en una muestra de varón.
26. Multiarray de sondas que comprende una sonda complementaria a un fragmento del promotor del gen de la protamina 1 que comprende la posición -190 del gen.
27. Uso de un multiarray tal como se define en la reivindicación 26, para la identificación de la presencia del polimorfismo -190C>A en una muestra de un varón humano.
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