Un método para controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente,

comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(a) la provisión de una planta modificada genéticamente o de células vegetales modificadas genéticamente, conteniendo dicha planta o dichas células vegetales un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína,

(b) la introducción de un segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en dichas células vegetales modificadas genéticamente de tal manera que no se introduzcan ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido o una parte funcional del mismo, conteniendo dicho segundo polipéptido

(i) un segundo fragmento de dicha proteína y

(ii) una secuencia peptídica que permita la introducción de dicho segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente,

por lo que dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento generan conjuntamente una función predeterminada de dicha proteína únicamente cuando están presentes conjuntamente y

por lo que las células de dicha planta contienen un ácido nucleico heterólogo adicional que está controlado por dicha función predeterminada

Método para controlar una planta o células vegetales modificadas geneticamente.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente, en particular a un método para controlar un proceso celular de interés en una planta o en células vegetales modificadas genéticamente. El método de la invención tiene una seguridad biológica excepcional. La invención se refiere además a una planta modificada genéticamente adaptada para dicho método y a una planta modificada genéticamente que ha sido controlada de acuerdo con el método de la invención. Además, la presente invención se refiere a un método para producir un producto en una planta modificada genéticamente mediante el control de un proceso celular de interés. El método de la invención permite el control selectivo de la expresión de un transgén en una planta modificada genéticamente de manera transitoria o de manera estable, mediante lo cual un proceso celular de interés no operativo previamente en la planta puede ser activado selectivamente a cualquier tiempo predeterminado.

Antecedentes de la invención

Sistemas de expresión de transgenes controlables en plantas

Uno de los problemas principales de la biotecnología vegetal es la consecución de un control fiable sobre la expresión de transgenes. Un estrecho control de la expresión génica en plantas es esencial si un producto corriente abajo de la expresión del transgén es inhibidor del crecimiento o tóxico, como por ejemplo plásticos biodegradables (Nawrath, Poirier y Somerville, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 12760-12764; John y Keller, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 12768-12773; US6103956; US5650555) o toxinas proteicas (US6140075). Las tecnologías existentes para controlar la expresión génica en plantas están basadas normalmente en promotores específicos de tejido e inducibles y prácticamente todos ellos adolecen de una actividad de expresión basal incluso cuando no son inducidos, esto es, hay fugas. Los promotores específicos de tejido (US05955361; WO09828431) representan una herramienta poderosa pero su uso está limitado a áreas de aplicaciones muy específicas, por ejemplo para producir plantas estériles (WO09839462) o para expresar genes de interés en semillas (WO00068388; US05608152). Los promotores inducibles pueden ser divididos en dos categorías de acuerdo con sus condiciones de inducción: aquéllos inducidos por factores abióticos (temperatura, luz, sustancias químicas) y aquéllos que pueden ser inducidos por factores bióticos, por ejemplo, por patógenos o por el ataque de una plaga. Ejemplos de la primera categoría son los promotores inducibles por calor (US05187287) y los inducibles por frío (US05847102), un sistema inducible por cobre (Mett y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 4567-4571), sistemas inducibles por esteroides (Aoyama y Chua, 1997, Plant J., 11, 605-612; McNellis y col., 1998, Plant J., 14, 247-257; US06063985), un sistema inducible por etanol (Caddick y col., 1997, Nature Biotech., 16, 177-180; WO09321334) y un sistema inducible por tetraciclina (Weinmann y col., 1994, Plant J., 5, 559-569). Uno de los últimos desarrollos en el área de los sistemas inducibles químicamente para plantas es un promotor quimérico que puede ser activado por el glucocorticoide dexametasona y desactivado por tetraciclina (Bohner y col., 1999, Plant J., 19, 87-95). Para una revisión de sistemas inducibles químicamente ver: Zuo y Chua (2000, Current Opin. Biotechnol., 11, 146-151). Otros ejemplos de promotores inducibles son promotores que controlan la expresión de genes relacionados con la patogénesis (PR) en plantas. Estos promotores pueden ser inducidos por el tratamiento de la planta con ácido salicílico, un componente importante de las rutas de generación de señales en plantas en respuesta al ataque de un patógeno, u otros compuestos químicos (benzo-1,2,3-tiadiazol o ácido isonicotínico) que son capaces de desencadenar la expresión de genes PR (US05942662).

Existen informes de sistemas de expresión de transgenes controlables utilizando ARN/ARN polimerasa vírica proporcionada por una infección vírica (ver, por ejemplo, US6093554; US5919705). En estos sistemas, una secuencia de ADN recombinante de la planta incluye secuencias de nucleótidos del genoma vírico reconocidas por ARN/ARN polimerasa vírica. La eficacia de estos sistemas es limitada debido a la baja capacidad de las polimerasas víricas para proporcionar funciones en trans y a su incapacidad para controlar procesos distintos de la amplificación del ARN. Otra forma es desencadenar un proceso de interés en un planta transgénica mediante la utilización de un virus modificado genéticamente que proporciona un ácido nucleico heterólogo que codifica un interruptor proteico para un proceso bioquímico en una planta genéticamente modificada (WO02068664, WO0071701 y WO0052146).

Los sistemas anteriormente descritos tienen un interés significativo como oportunidades para obtener patrones deseados de expresión transgénica, pero no permiten un estrecho control de los patrones de expresión, ya que los agentes inductores (cobre) o sus análogos (brassinoesteroides en el caso de sistemas controlables por esteroides) pueden estar presentes en los tejidos de la planta a niveles suficientes para producir una expresión residual. Adicionalmente, la utilización de antibióticos y esteroides como inductores químicos no es deseable o no es factible económicamente para aplicaciones a gran escala. Cuando se utilizan promotores de genes PR o ARN/ARN polimerasas víricas como medio de control de los transgenes, no se cumplen tampoco los requisitos de un estrecho control sobre la expresión del transgén, ya que una infección patógena casual o un estrés fortuito pueden producir la expresión. Los promotores específicos de tejido o de órgano están limitados a áreas de aplicación muy estrechas, ya que confinan la expresión a un órgano específico o a una etapa específica del desarrollo de la planta, pero no permiten que el transgén sea activado a voluntad. Los interruptores víricos recombinantes, según se describe en WO02/068664 abordan todos estos problemas, pero no garantizan los estrictos requisitos de seguridad medioambiental, ya que el ácido nucleico heterólogo del vector vírico puede recombinarse.

Existe una abundante literatura, incluyendo solicitudes de patente, que describe el diseño de plantas resistentes a virus por la expresión de genes víricos o de formas mutadas de ARN vírico (por ejemplo, US5792926; US6040496). Sin embargo, existe un riesgo medioambiental asociado con la utilización de tales plantas debido a la posibilidad de que se formen nuevos virus por la recombinación entre el virus de desafío y el ARN o el ADN vírico transgénico (Adair y Kearney, 2000, Arch. Virol., 145, 1867-1883).

Hooykaas y colaboradores (2000, Science, 290, 979-982; WO01/89283) describen la utilización de una fusión traduccional de la recombinasa Cre con fragmentos del gen vir para la translocación de la recombinasa mediada por Agrobacterium en células vegetales. Los acontecimientos de recombinación in planta mediados por Cre tenían como resultado un fenotipo seleccionable. La translocación de la recombinasa Cre es la primera utilización de una proteína translocada como interruptor para desencadenar un proceso de interés en células vegetales. Sin embargo, a pesar de que la translocación no está acompañada necesariamente por la transferencia de ADN, este procedimiento no garantiza un nivel de seguridad elevado, ya que el microorganismo fitopatógeno modificado genéticamente (Agrobacterium) posee una secuencia codificadora completa del interruptor proteico recombinasa Cre. Además, el proceso de interés puede ser desencadenado únicamente en las células que reciban el interruptor proteico. Si van a tratarse grandes conjuntos de células, la proporción de células que reciben el interruptor proteico con respecto al número total de células resulta muy pequeña. Por tanto, el método de Hooykaas no puede ser aplicado a plantas completas. En su lugar, su utilidad está limitada a células en cultivo de tejidos o cultivo de células. Además, como este método está limitado a cultivos celulares (a escala de laboratorio), no surgen los problemas de seguridad medioambiental que aparecen en las aplicaciones a gran escala o de campos de cultivo.

Es por tanto un objeto de la invención proporcionar un método medioambientalmente seguro...

1. Un método para controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

por lo que dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento generan conjuntamente una función predeterminada de dicha proteína únicamente cuando están presentes conjuntamente y

por lo que las células de dicha planta contienen un ácido nucleico heterólogo adicional que está controlado por dicha función predeterminada.

2. El método de la reivindicación 1, en el que una parte de dicho segundo polipéptido es funcional si es capaz de generar dicha función predeterminada conjuntamente con dicho primer polipéptido.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha función predeterminada controla un proceso celular de interés.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicha función predeterminada da lugar a la formación de un ARN y/o un producto de expresión proteico a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicha función predeterminada da lugar a la formación de un operón expresable a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional o a partir de un producto de expresión del mismo.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dicha función predeterminada da lugar a la formación de un amplicón expresable a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional o a partir de un producto de expresión del mismo.

7. El método de la reivindicación 1 ó 6, en el que dicha función predeterminada de dicha proteína da lugar a la formación de un amplicón de ADN o de ARN a partir de dicho ácido nucleico heterólogo adicional, donde dicho amplicón tiene una o más de las capacidades siguientes: replicación, expresión de proteínas, movimiento célula a célula, movimiento sistémico, ensamblaje de partículas infectivas, infectividad, supresión de la capacidad de silenciación de genes vegetales, modificación de la condición fisiológica de la planta.

8. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho ácido nucleico heterólogo adicional está integrado de manera estable en el genoma nuclear o plastídico de dicha planta o de dichas células vegetales.

9. El método de una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la generación de dicha función predeterminada de dicha proteína incluye la interacción no covalente de dicho primer y dicho segundo fragmento.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicha interacción no covalente está facilitada por polipéptidos con afinidad específica entre sí.

11. El método de la reivindicación 9, en el que dicha interacción no covalente está facilitada por polipéptidos con cremallera de leucina fusionados a dicho primer y a dicho segundo fragmento.

12. El método de la reivindicación 9, en el que dicha interacción no covalente está facilitada por polipéptidos dimerizantes fusionados a dicho primer y a dicho segundo fragmento y está regulada por moléculas dimerizantes tales como rapamicina o análogos de rapamicina.

13. El método de una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la generación de dicha función predeterminada de dicha proteína incluye la formación de enlaces covalentes entre dicho primer y dicho segundo fragmento.

14. El método de la reivindicación 13, en el que dicha formación de enlaces covalentes incluye la unión o el ayuste en trans basados en inteína entre dicho primer y dicho segundo fragmento.

15. El método de una de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha secuencia peptídica del punto (b, ii) es o contiene una secuencia de translocación membranal para facilitar la introducción de dicho segundo polipéptido en dichas células vegetales o en células de dicha planta modificada genéticamente.

16. El método de una de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha introducción de dicho segundo polipéptido es realizada utilizando un microorganismo patógeno que tenga un sistema para la administración de un polipéptido a una célula huésped.

17. El método de la reivindicación 16, en el que dicho microorganismo patógeno es un Agrobacterium virulento o no virulento.

18. El método de la reivindicación 16, en el que dicho microorganismo patógeno es fitopatógeno y es una bacteria virulenta o no virulenta dotada con un sistema de secreción de tipo III.

19. El método de la reivindicación 18, en el que dicho microorganismo fitopatógeno es una bacteria virulenta o no virulenta de uno de los géneros siguientes: Bordetella, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Yersinia,

20. El método de una de las reivindicaciones 1 a 19, en el que dicho segundo polipéptido contiene uno o más péptidos de tránsito o señal para transferir dicho segundo polipéptido a orgánulos de la célula seleccionados del grupo siguiente: núcleo, plástidos, mitocondrias, sistema de Golgi, vacuolas.

21. El método de una de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicha función predeterminada de dicha proteína es seleccionada del grupo siguiente: replicación de ADN, recombinación de ADN, transcripción, recombinación de ARN, amplificación, traducción.

22. El método de una de las reivindicaciones 1 a 21, en el que dicha proteína es capaz de moverse célula a célula o de movimiento sistémico en dicha planta o en una parte de dicha planta.

23. El método de la reivindicación 22, en el que dicha proteína contiene un dominio de una proteína de movimiento vírica, un dominio de una proteína de revestimiento vírica o un dominio de un factor de transcripción vegetal o animal capaz de movimiento célula a célula o sistémico.

24. El método de la reivindicación 23, en el que dicho dominio capaz de movimiento célula a célula o sistémico es un polipéptido diseñado artificialmente.

25. El método de una de las reivindicaciones 1 a 24, en el que dicha planta proporcionada en la etapa (a) es una planta transgénica que contiene dicho ácido nucleico heterólogo integrado de manera estable en el genoma nuclear de las células.

26. El método de una de las reivindicaciones 1 a 24, en el que dicha planta proporcionada en la etapa (a) es una planta transgénica que contiene dicho ácido nucleico heterólogo integrado de manera estable en el genoma plastídico de las células.

27. El método de una de las reivindicaciones 1 a 24, en el que las células de dicha planta proporcionada en la etapa (a) son transformadas de manera transitoria con dicho ácido nucleico heterólogo.

28. Una planta o células vegetales modificadas genéticamente que contienen un ácido nucleico heterólogo que codifica un primer polipéptido que contiene o que consta de un primer fragmento de una proteína, donde dicha planta o dichas células vegetales modificadas genéticamente contiene(n) un segundo polipéptido que contiene (i) un segundo fragmento de dicha proteína y (ii) una secuencia peptídica que facilita la introducción de dicho segundo polipéptido en las células de dicha planta modificada genéticamente o en las células vegetales modificadas genéticamente;

por lo que dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento generan conjuntamente una función predeterminada de dicha proteína únicamente cuando dicho primer y dicho segundo fragmento están presentes conjuntamente;

no teniendo dicha planta o dichas células vegetales ácidos nucleicos que codifiquen dicho segundo polipéptido o una parte funcional del mismo; y

donde dicha planta o dichas células vegetales modificadas genéticamente contiene(n) además un ácido nucleico heterólogo adicional que está controlado por dicha función predeterminada.

29. Un sistema para controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente, que comprende

por lo que dicha planta o dichas células vegetales modificadas genéticamente y dicho segundo polipéptido están diseñados de tal manera que dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento son capaces de generar conjuntamente una función predeterminada de dicha proteína tras la inserción de dicho segundo polipéptido en dicha planta o en dichas células vegetales; donde dicho ácido nucleico heterólogo adicional está controlado por dicha función predeterminada.

30. Un sistema para controlar una planta o células vegetales modificadas genéticamente, que comprende

por lo que dicha planta o dichas células vegetales modificadas genéticamente y dicho segundo polipéptido están diseñados de tal manera que dicho primer fragmento y dicho segundo fragmento son capaces de generar conjuntamente una función predeterminada de dicha proteína tras la inserción de dicho segundo polipéptido en dicha planta o en dichas células vegetales; donde dicho ácido nucleico heterólogo adicional está controlado por dicha función predeterminada.