PROCEDIMIENTOS Y MEDIOS DE SUPERVISION Y MODULACION DEL SILENCIAMIENTO GENICO.
Un procedimiento de supervisión de la reducción de la expresión de un gen diana en una célula de un organismo eucariota,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas de
a) proporcionar a la célula de dicho organismo eucariota un ARNbc que comprende una primera región, una segunda región, una tercera región y una cuarta región
i) comprendiendo dicha primera región una secuencia de nucleótidos de al menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene al menos un 94% de identidad de secuencia con 19 nucleótidos consecutivos de una región de nucleótidos con sentido de dicho gen diana;
ii) comprendiendo dicha segunda región una secuencia de nucleótidos de al menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene al menos un 94% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos complementaria a 19 nucleótidos consecutivos de dicha región de nucleótidos con sentido del gen diana;
iii) siendo capaces dicha primera región y dicha segunda región de formar una región de ARN bicatenario;
iv) comprendiendo dicha tercera región una secuencia de nucleótidos de al menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene al menos un 94% de identidad de secuencia con 19 nucleótidos consecutivos de una región de nucleótidos con sentido de un segundo gen presente en dicha célula eucariota y que es diferente de dicho gen diana;
v) comprendiendo dicha cuarta región una secuencia de nucleótidos de al menos 19 nucleótidos consecutivos que tiene al menos un 94% de identidad de secuencia con el complemento de dichos 19 nucleótidos consecutivos de dicha región de nucleótidos con sentido de dicho segundo gen;
vi) siendo capaces dicha tercera y cuarta región de formar una región de ARN bicatenario; y
b) supervisar la reducción de la expresión de dicho gen diana mediante el análisis de la reducción en expresión de dicho segundo gen,
en el que el organismo eucariota es una planta, una levadura, un hongo, un moho, o un animal, a condición de que cuando dicho organismo es un animal, la célula no sea una célula en un cuerpo humano o animal
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/AU03/00293.
Solicitante: COMMONWEALTH SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANISATION.
Nacionalidad solicitante: Australia.
Dirección: LIMESTONE AVENUE,CAMPBELL, ACT 2612.
Inventor/es: WATERHOUSE,PETER, WESLEY,SUSAN, HELLIWELL,CHRIS.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 2 de Junio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/82B4
Clasificación PCT:
- C12N15/11 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Clasificación antigua:
Fragmento de la descripción:
Procedimientos y medios de supervisión y modulación del silenciamiento génico.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para alterar la expresión de genes en organismos eucariotas, tales como plantas, pero también en animales tales como nemátodos, insectos y artrópodos, mamíferos incluyendo humanos, o levaduras, hongos o mohos, usando ARNbc capaz de alterar la expresión de genes diana, o genes que codifican dicho ARNbc. También se proporcionan organismos eucariotas no humanos que comprenden dicho ARNbc o genes que lo codifican.
En un primer aspecto, la invención proporciona procedimientos y medios para supervisar el silenciamiento de un gen diana en una célula eucariota midiendo el grado de silenciamiento de un segundo gen, en los que el silenciamiento del gen diana y del segundo gen se obtiene a través de la acción de una única molécula de ARNbc inicial proporcionada a la célula eucariota.
En un segundo aspecto, la invención proporciona procedimientos y medios para modular el grado de silenciamiento de un gen diana en una célula eucariota, incluyendo en la molécula única inicial de ARNbc proporcionada a la célula eucariota además del ARNbc diana que induce el silenciamiento del gen diana, una cantidad de secuencias de ARNbc no relacionadas con el ARNbc diana, en una proporción que refleja la modulación deseada del grado de silenciamiento del gen diana.
Técnica antecedente
Hasta recientemente, se conocían dos procedimientos predominantes para la modulación de la expresión génica en organismos eucariotas, que se conocen en la técnica como regulación negativa "antisentido" o regulación negativa "con sentido".
Trabajos recientes han demostrado que la eficacia silenciadora podría mejorarse mucho tanto a nivel cuantitativo como cualitativo usando construcciones quiméricas que codifican ARN capaz de formar ARN bicatenario mediante la formación de pares de bases entre las secuencias de nucleótidos de ARN antisentido y con sentido respectivamente complementarias y homólogas a las secuencias diana. Tales ARN bicatenarios (ARNbc) también se conocen como ARN en horquilla (ARNh) o ARN interferente (ARNi).
La regulación negativa de la expresión de secuencias de nucleótidos diana usando ARNbc se ha descrito como un procedimiento de análisis conveniente para el esclarecimiento de la función de ácidos nucleicos cuyo papel se desconoce (véase, por ejemplo, el documento WO99/53050 o WO00/01846). El silenciamiento génico mediado por ARNbc también puede usarse para modular la expresión de uno o más genes diana en un organismo para obtener un organismo modificado con un fenotipo o rasgo deseado (documento WO99/53050).
Sería útil para las aplicaciones anteriormente mencionadas tener una forma de supervisar fácilmente la regulación negativa cuantitativa y cualitativa de los ácidos nucleicos diana. Esto es especialmente cierto cuando la determinación de la regulación negativa de la expresión del gen diana a través del análisis del fenotipo causado por la regulación negativa es costosa en mano de obra, coste y tiempo, requiere el uso de procedimientos de análisis especializados, etc. Cuando el silenciamiento génico mediado por ARNbc se usa para identificación/validación de la función de genes desconocidos, en los que por definición el fenotipo a buscar no se conoce, puede ser fundamental tener un procedimiento alternativo para supervisar la eficacia del silenciamiento.
Además, sería conveniente poder modular el grado de silenciamiento de un gen o genes diana particulares en un organismo, por ejemplo generando una población de organismos que exhiben un amplio espectro en los grados individuales de silenciamiento génico mediado por ARNbc e identificando los organismos con el grado de silenciamiento deseado.
Fire y col., 1998, describen interferencia genética específica por introducción experimental de ARN bicatenario en Caenorhabditis elegans.
El documento WO 99/32619 proporciona un procedimiento para introducir un ARN en una célula viva para inhibir la expresión génica de un gen diana en esa célula. El procedimiento puede ponerse en práctica ex vivo o in vivo. El ARN tiene una región con estructura bicatenaria. La inhibición es específica de secuencia puesto que las secuencias de nucleótidos de la región doble del ARN y/o una porción del gen diana son idénticas.
Waterhouse y col. 1998, describen que la resistencia a virus y el silenciamiento génico en plantas pueden inducirse mediante expresión simultánea de ARN con sentido y antisentido. El ARN con sentido y antisentido puede localizarse en un transcrito que tenga autocomplementariedad.
Hamilton y col. 1998, describe que un transgén con ADN repetido, es decir, copias invertidas de su región no traducida 5', causa supresión post-transcripcional, de alta frecuencia, de la expresión de ACC-oxidasa en tomate.
El documento WO 98/53083 describe construcciones y procedimientos para mejorar la inhibición de un gen diana dentro de un organismo que implican insertar en el vector de silenciamiento génico una secuencia de repetición invertida de toda o parte de una región polinucleotídica dentro del vector.
El documento WO 99/53050 proporciona procedimientos y medios para reducir la expresión fenotípica de un ácido nucleico de interés en células eucariotas, especialmente en células vegetales, introduciendo genes quiméricos que codifican moléculas de ARN con sentido y antisentido dirigidas hacia el ácido nucleico diana. Estas moléculas son capaces de formar una región ARN bicatenaria mediante la formación de pares de bases entre las regiones con las secuencias de nucleótidos con sentido y antisentido o mediante la introducción de las propias moléculas de ARN. Preferentemente, las moléculas de ARN comprenden simultáneamente secuencias de nucleótidos tanto con sentido como antisentido.
El documento WO 99/49029 se refiere, en general, a un procedimiento para modificar la expresión génica y a genes sintéticos para modificar la expresión de genes endógenos en una célula, tejido u órgano de un organismo transgénico, en particular en un animal o planta transgénica. También se proporcionan genes sintéticos y construcciones genéticas capaces de formar un ARNbc que son capaces de reprimir, retrasar o reducir de otra manera la expresión de un gen endógeno o un gen diana de un organismo cuando se introducen en él.
El documento WO 99/61631 se refiere a procedimientos para alterar la expresión de un gen diana en una planta usando fragmentos de ARN con sentido y antisentido del gen. Los fragmentos de ARN con sentido y antisentido son capaces de emparejarse y formar una molécula de ARN bicatenario, alterando así la expresión del gen. La presente invención también se refiere a plantas, su progenie y semillas de las mismas obtenidas usando estos procedimientos.
El documento WO 00/01846 proporciona un procedimiento para identificar ADN responsable de conferir un fenotipo particular en una célula, comprendiendo dicho procedimiento a) construir una genoteca de ADNc o genómica del ADN de la célula en un vector adecuado en una orientación relativa a un promotor o promotores capaces de iniciar la transcripción del ADNc o ADN a ARN bicatenario (bc) tras la unión de un factor de transcripción apropiado al promotor o promotores; b) introducir la genoteca en una o más células que comprenden el factor de transcripción, y c) identificar y aislar un fenotipo particular de una célula que comprende la genoteca e identificar el fragmento de ADN o ADNc de la genoteca responsable de conferir el fenotipo. Usando esta técnica, también es posible asignar función a una secuencia de ADN conocida mediante a) la identificación de homólogos de la secuencia de ADN en una célula, b) el aislamiento del homólogo o los homólogos del ADN pertinente o un fragmento del mismo de la célula, c) la clonación del homólogo o fragmento del mismo en un vector apropiado en una orientación relativa a un promotor adecuado capaz de iniciar la transcripción de ARNbc a partir de dicho homólogo de ADN o fragmento tras la unión de un factor de transcripción apropiado al promotor y d) introducir el vector en la célula de la etapa a) que comprende el factor de transcripción.
El documento WO 00/44914 también describe una composición y procedimientos para la atenuación in vivo e in vitro de la expresión génica usando ARN bicatenario, especialmente en pez cebra.
El documento WO 00/49035 describe un procedimiento...
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento de supervisión de la reducción de la expresión de un gen diana en una célula de un organismo eucariota, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de
en el que el organismo eucariota es una planta, una levadura, un hongo, un moho, o un animal, a condición de que cuando dicho organismo es un animal, la célula no sea una célula en un cuerpo humano o animal.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho organismo eucariota se selecciona del grupo constituido por algodón, patata, maíz, trigo, arroz, caña de azúcar, colza, Arabidopsis, remolacha azucarera, tabaco y soja.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que dicho organismo eucariota se selecciona del grupo constituido por insectos, marisco, moluscos, crustáceos, cangrejos, langostas, gambas, peces, aves, mamíferos y seres humanos.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho segundo gen es un gen endógeno presente en dicha célula de dicho organismo eucariota.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho segundo gen es un transgén integrado de forma estable en el genoma de dicha célula de dicho organismo eucariota.
6. El procedimiento de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que dicho organismo es una planta y dicho segundo gen se selecciona del grupo que consiste en PDS, EIN2, FLC y PhyB.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha célula de dicho organismo eucariota comprende un gen GUS o GFP expresado de forma funcional y dicho segundo gen es un gen GUS o GFP.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las regiones de ARN bicatenario formadas entre la primera y la segunda región y la región de ARN bicatenaria formada entre la tercera y cuarta región son aproximadamente iguales en tamaño.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha primea y segunda región y dicha tercera y cuarta región tienen una longitud de aproximadamente 300 nt.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho ARNbc se transcribe a partir de un gen quimérico comprendido dentro de las células de dicho organismo eucariota, comprendiendo dicho gen quimérico:
11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho gen quimérico está integrado de forma estable en el genoma de células de dicho organismo eucariota.
12. Una molécula de ARN como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la que las regiones de ARN bicatenario formadas entre la primera y la segunda región y la región de ARN bicatenario formada entre la tercera y cuarta región son aproximadamente iguales en tamaño.
13. Uso de una molécula de ARN de acuerdo con la reivindicación 12 para medir la reducción de expresión de un gen diana en una célula de un organismo eucariota, en el que dicho organismo eucariota es una planta, una levadura, un hongo, un moho o un animal, a condición de que cuando dicho organismo es un animal la célula no sea una célula de un cuerpo humano o animal.
14. Uso de una molécula de ARN de acuerdo con la reivindicación 12, para reducir la expresión de dicho gen diana y dicho segundo gen en una célula de un organismo eucariota, en el que dicho organismo eucariota es una planta, una levadura, un hongo, un moho o un animal, a condición de que cuando dicho organismo es un animal, la célula no sea una célula en un cuerpo humano o animal.
15. Una molécula de ADN para medir la reducción de la expresión de un gen diana en una célula de un organismo eucariota, que comprende
16. Uso de una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 15 para medir la expresión de dicho gen diana mediante la medición de la reducción de la expresión de dicho segundo gen en una célula de un organismo eucariota, en el que dicho organismo eucariota es una planta, una levadura, un hongo, un moho o un animal, a condición de que cuando dicho organismo es un animal, la célula no es una célula en un cuerpo animal o humano.
17. Uso de una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 15 para reducir la expresión de dicho gen diana y dicho segundo gen, en una célula de un organismo eucariota, en el que dicho organismo eucariota es una planta, una levadura, un hongo, un moho o un animal, a condición de que cuando dicho organismo es un animal, la célula no sea una célula en un cuerpo humano o animal.
18. Un organismo eucariota no humano que comprende una molécula de ARN de acuerdo con la reivindicación 12.
19. Un organismo eucariota no humano que comprende una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 15.
20. El organismo eucariota no humano de acuerdo con las reivindicaciones 18 ó 19, que se selecciona de una planta, un animal, una levadura, un hongo o un moho.
21. Un procedimiento para identificar, dentro de una población de organismos eucariotas con silenciamiento génico mediado por ARNbc, los organismos con el grado deseado de silenciamiento de un gen diana, que comprende:
22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que las regiones de ARN bicatenario formadas entre la primera y la segunda región y la región de ARN bicatenario formada entre la tercera y cuarta región son aproximadamente iguales en tamaño.
Patentes similares o relacionadas:
COMPOSICIONES Y MÉTODOS QUE UTILIZAN INTERFERENCIA DE ARN DE TIPO CDPK PARA EL CONTROL DE NEMÁTODOS, del 7 de Febrero de 2012, de BASF PLANT SCIENCE GMBH: Un método para conferir resistencia a los nematodos a una planta, comprendiendo dicho método las etapas de: a) preparar un ácido nucleico que codifica una […]
MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN SIMULTÁNEA DE MÚLTIPLES PROTEÍNAS; VECTORES Y CÉLULAS PARA SU USO EN EL MISMO, del 30 de Junio de 2011, de CHROMAGENICS B.V.: Célula que comprende dos unidades de expresión de proteínas que codifican cada una para al menos una proteína de interés, caracterizada por que: […]
SECUENCIAS DE ADN CON ACTIVIDAD ANTI-REPRESORA, del 17 de Agosto de 2010, de CHROMAGENICS B.V.: Una secuencia de ADN aislada y/o recombinante que tiene actividad anti-represora, seleccionada dicha secuencia del grupo que consiste en: (a) el SEQ ID: 27 […]
SECUENCIAS DE ADN CON ACTIVIDAD ANTI-REPRESORA, del 17 de Agosto de 2010, de CHROMAGENICS B.V.: Una secuencia de ADN aislada y/o recombinante que tiene actividad anti-represora, seleccionada dicha secuencia del grupo que consiste en: (a) el SEQ ID: 44 de la Figura […]
SECUENCIAS DE ADN CON ACTIVIDAD ANTI-REPRESORA, del 17 de Agosto de 2010, de CHROMAGENICS B.V.: Un constructo de ADN recombinante proveído de una secuencia de ADN que tiene actividad anti-represora, dicho constructo de ADN recombinante que comprende […]
SECUENCIAS DE ADN CON ACTIVIDAD ANTI-REPRESORA, del 17 de Agosto de 2010, de CHROMAGENICS B.V.: Una secuencia de ADN aislada y/o recombinante que tiene actividad anti-represora, seleccionada dicha secuencia del grupo que consiste en: (a) […]
SECUENCIAS DE ADN CON ACTIVIDAD ANTI-REPRESORA, del 17 de Agosto de 2010, de CHROMAGENICS B.V.: Una secuencia de ADN aislada y/o recombinante que tiene actividad anti-represora, seleccionada dicha secuencia del grupo que consiste en: (a) […]
Método para analizar ácido nucleico molde, método para analizar sustancia objetivo, kit de análisis para ácido nucleico molde o sustancia objetivo y analizador para ácido nucleico molde o sustancia objetivo, del 29 de Julio de 2020, de Kabushiki Kaisha DNAFORM: Un método para analizar un ácido nucleico molde, que comprende las etapas de: fraccionar una muestra que comprende un ácido nucleico molde […]