METODO DE IDENTIFICACION DE DOMINIOS DE SITIOS DE UNION QUE CONSERVAN LA CAPACIDAD DE UNIRSE A UN EPITOPO.

Un método para identificar un dominio de sitio de unión que tiene la capacidad de unirse a un epítopo predeterminado cuando se sitúa en posición C-terminal con respecto a al menos un dominio adicional en un polipéptido bi- o multivalente recombinante,

que comprende las etapas de

(a) ensayar un panel de dominios de sitio de unión presentados en la superficie de un sistema de presentación biológica como parte de una proteína fusión para unirse a un epítopo predeterminado, donde dicha proteína de fusión comprende

(i) un dominio de bloqueo N-terminal adicional que es o procede del dominio N2 del producto del gen III del fago filamentoso y que se sitúa en posición N-terminal con respecto a dicho dominio de sitio de unión y

(ii) una secuencia de aminoácidos que interviene en el anclaje de la proteína de fusión a la superficie de dicho sistema de presentación; y

(b) identificar un dominio de sitio de unión que se une a dicho epítopo determinado

Método de identificación de dominios de sitios de unión que conservan la capacidad de unirse a un epítopo.

La presente invención se refiere a un método de identificación de dominios que tienen afinidad de unión por un epítopo preseleccionado. Los dominios comprenden preferiblemente dominios V_H y V_L de inmunoglobulina que conservan la capacidad de unirse a un epítopo cuando se sitúan en posición C-terminal con respecto a al menos un dominio adicional en un polipéptido bi- o multivalente recombinante. La presente invención se refiere además a un kit que comprende componentes tales como paneles de vectores recombinantes o bibliotecas bacterianas transfectadas con un panel de vectores recombinantes, que es útil en la realización del método de la invención. Además, la presente invención se refiere a polipéptidos que pueden obtenerse mediante el método descrito anteriormente y a su uso en composiciones farmacéuticas y de diagnóstico.

Los receptores multivalentes tales como construcciones de anticuerpos bifuncionales recombinantes desempeñan un papel terapéutico y científico cada vez más importante, en particular en el campo de la medicina, por ejemplo, en el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento para el cáncer y enfermedades autoinmunes o como herramientas interesantes para el análisis y la modulación de rutas de transducción de señales celulares, habiéndose hecho trabajos pioneros usando dichos receptores.

Por lo tanto, por entrecruzamiento del antígeno de activación CD3 en células T con un antígeno asociado a tumor en células tumorales, anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla pueden reunir ambas células de modo que la célula tumoral se lise eficazmente durante el contacto célula-célula (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025). Se han desarrollado o se están desarrollando estrategias comparables para otras células diana (por ejemplo, células infectadas por virus) y para el reclutamiento de otras poblaciones celulares efectoras (por ejemplo, células NK y fagocitos mononucleares). Usando proteínas de fusión bifuncionales que llevan un fragmento de anticuerpo como mecanismo de dirección, un gran número de receptores y ligandos diferentes pueden unirse específicamente a moléculas de superficie definidas en poblaciones celulares seleccionados. Es particularmente interesante que las moléculas de superficie en la misma célula puedan entrecruzarse por anticuerpos biespecíficos para modular la función celular o el estado de activación o diferenciación de dichas células. Una aplicación posible de este tipo de estrategia puede ser la inducción de anergia en linfocitos B o T autoagresivos que desempeñan un papel patógeno en muchas enfermedades autoinmunes. Con respecto a la amplia importancia científica y terapéutica, son de particular importancia métodos eficaces y reproducibles para producir polipéptidos recombinantes que comprenden sitios de unión a antígeno funcionales; dichos métodos producen, por ejemplo, construcciones de anticuerpos biespecíficos funcionalmente activos por expresión en bacterias y en células de mamífero. Dichas proteínas de cadena sencilla bifuncionales recombinantes habitualmente están constituidas por diferentes fragmentos de anticuerpo scFv, consistiendo cada uno de ellos en un dominio de unión a antígeno de cadena pesada variable (V_H) y uno de cadena ligera variable (V_L) de inmunoglobulina. Como alternativa, pueden comprender dicho fragmento de anticuerpo y una parte que no pertenece a una inmunoglobulina. Todos los dominios funcionales se localizan en una sola cadena polipeptídica y se unen por enlazadores peptídicos Glicina-Serina flexibles u otros enlazadores peptídicos apropiados. La cadena polipeptídica bifuncional puede producirse como una proteína funcional por transfección de células hospedadoras de mamífero, o menos preferentemente otras células hospedadoras, con la secuencia de ADN correspondiente que además puede codificar un marcador de proteína opcional, preferiblemente un marcador de polihistidina, lo cual facilita la purificación de la proteína recombinante, por ejemplo usando una columna de quelato de níquel. La producción de construcciones multivalentes y preferiblemente bifuncionales de acuerdo con esta estrategia de cadena sencilla tiene ventajas importantes en comparación con métodos convencionales usando heterodi- o multimerización in vitro o in vivo de dominios funcionales expresados de forma independiente, un procedimiento que puede ser muy laborioso y que frecuentemente se asocia con bajos rendimientos. La aparición de homodímeros contaminantes se excluye mediante la estrategia de cadena sencilla, dando como resultado por lo tanto preparaciones de proteína de alta pureza y rendimiento, puesto que toda la proteína recombinante producida consiste en el 100% de la construcción bifuncional deseada. Como se ha demostrado a modo de ejemplo con un anticuerpo de cadena sencilla biespecífico expresado de forma funcional en células CHO, los fragmentos de anticuerpo scFv pueden unirse en principio a su antígeno como la parte N-terminal o C-terminal de una construcción de cadena sencilla bifuncional (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(1995) 7021-7025).

Sin embargo, muchos dominios funcionales de polipéptidos multivalentes tales como fragmentos de anticuerpo pierden su actividad de unión cuando se localizan en posición C-terminal con respecto a una estructura proteica tridimensional adicional dentro de una proteína de fusión. Por ejemplo, fragmentos de scFv derivados de anticuerpos seleccionados aleatoriamente producidos por líneas celulares de hibridoma o seleccionados in vitro a partir de bibliotecas de anticuerpos combinatorias pierden frecuentemente su actividad de unión a antígeno cuando se localizan en la posición C-terminal dentro de proteínas de cadena sencilla bifuncionales recombinantes, aunque los mismos pares V_H/V_L se unen al antígeno cuando se localizan en el extremo N-terminal o como anticuerpos completos o fragmentos scFv monovalentes libres (Figura 10). Este fenómeno, a modo de ejemplo de referencia, se caracterizó exhaustivamente con moléculas de cadena sencilla bifuncionales recombinantes que consistían en el extremo N-terminal de la parte extracelular de CD80 humano (B7-1) seguido en el extremo C-terminal de diferentes fragmentos scFv derivados de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno 17-1A (Figura 1.1). De cuatro anticuerpos específicos de 17-1A diferentes, habiéndose producido tres de ellos por líneas celulares de hibridoma murino y habiéndose seleccionado uno in vitro a partir de una biblioteca de anticuerpos combinatoria humana usando el método de presentación en fagos, ninguno daba origen a un fragmento scFv que conservara su actividad de unión a antígeno cuando se fusionaba con su extremo N-terminal al extremo C-terminal del fragmento de CD80 humano y se expresaba como molécula de cadena sencilla bifuncional en células CHO (Ejemplos 1-4). Es digno de atención que dos de los fragmentos de anticuerpo murino (M79 y M74) se unen al antígeno 17-1A como parte N-terminal de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1995) 7021-7025) así como en forma de fragmentos scFv monovalentes libres, habiéndose demostrado esto último también para el anticuerpo específico de 17-1A humano VD4.5VK8 (Ejemplo 3) obtenido in vitro a partir de una biblioteca de fagos. Las cuatro especificidades se unen al antígeno 17-1A en forma de moléculas de anticuerpo completas. Por consiguiente, el problema técnico subyacente a la presente invención era proporcionar medios y métodos para identificar polipéptidos bi- o multivalentes que comprendieran sitios de unión a anticuerpo capaces de unirse eficazmente al antígeno correspondiente. La solución a dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método de identificación de un dominio de sitio de unión que tiene la capacidad de unirse a un epítopo predeterminado cuando se sitúa en posición C-terminal con respecto a al menos un dominio adicional en un polipéptido bi- o multivalente recombinante, que comprende las etapas de:

(a) ensayar un panel de dominios de sitio de unión presentados en la superficie de un sistema de presentación biológico como parte de una proteína fusión para la unión a un epítopo predeterminado, donde dicha proteína de fusión comprende

1. Un método para identificar un dominio de sitio de unión que tiene la capacidad de unirse a un epítopo predeterminado cuando se sitúa en posición C-terminal con respecto a al menos un dominio adicional en un polipéptido bi- o multivalente recombinante, que comprende las etapas de

(a) ensayar un panel de dominios de sitio de unión presentados en la superficie de un sistema de presentación biológica como parte de una proteína fusión para unirse a un epítopo predeterminado, donde dicha proteína de fusión comprende