Un método in vitro para producir una proteína IL-18BP recombinante en un sistema de mamífero que se caracteriza porque

(i) dicha proteína IL-18BP recombinante exhibe homogeneidad de aminoácidos N-terminal;

y

(ii) dicho método comprende la etapa de reemplazar la secuencia endógena de péptido señal del ADN que codifica dicha proteína IL-18BP por la del péptido señal de hormona de crecimiento humana (hGH)

Mejora de la homogeneidad y secreción de proteínas recombinantes en sistemas de mamíferos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para mejorar la homogeneidad y/o la secreción de una proteína recombinante de interés expresada en células de mamífero reemplazando la secuencia de péptido señal endógeno del ADN que codifica la proteína de interés por la de hGH humana. La invención también se refiere a vectores de expresión de ADN que contienen la secuencia que codifica dichas proteínas fusionada a la secuencia de péptido señal de la hGH y a células que contienen dichos vectores.

Antecedentes de la invención

La secreción proteica es uno de los eventos más importantes de la producción de proteínas en el campo de la biotecnología. Este proceso consta de las siguientes etapas: en primer lugar, la translocalización a lo largo de la membrana de retículo endoplasmático (RE); en segundo lugar la N-glicosilación y el plegamiento en el lumen de RE; en tercer lugar, salida del RE; en cuarto lugar, modificaciones en el aparato de Golgi; y finalmente la liberación desde los gránulos secretores hacia el espacio extracelular (Sakaguchi 1997). El hecho de que una proteína sea secretada o no desde las células depende principalmente de si puede translocalizarse a través de la membrana y de si puede plegarse correctamente en el lumen del RE. La translocalización de membrana en células de mamífero es obligatoriamente acoplada. Tras la translocalización de membrana, los péptidos nacientes son liberados al espacio lumenal y se pliegan con ayuda de diversos chaperones y enzimas de plegamiento. Las proteínas plegadas incorrectamente quedan atrapadas dentro del RE y por tanto no pueden avanzar hacia los compartimentos secretores. En procesos biotecnológicos en los que se produce una expresión masiva de proteínas, la secreción puede suponer un cuello de botella y limitar la velocidad de expresión.

Los péptidos señal o secuencias líder están localizados en los extremos amino de los polipéptidos nacientes. Dirigen proteínas a la ruta secretora y son separados de la cadena naciente una vez que se han translocalizado en la membrana del retículo endoplasmático.

El péptido señal consta de tres regiones: una región polar aminoterminal (región N), en la que se observan frecuentemente residuos de aminoácido cargados positivamente; una región hidrofóbica central (región H) de más de 7-8 residuos de aminoácido hidrofóbicos; y una región carboxiterminal (región C) que incluye la posición de separación del péptido señal (Sakaguchi, 1997). Las regiones H eucarióticas están dominadas por Leu con alguna presencia de Val, Ala, Phe e Ile. La separación del péptido señal de la proteína madura se produce en una posición específica y la especificidad de separación reside en el último residuo de la secuencia señal (Nielsen y col., 1997). Cerca de la posición de separación -3 y -1 la alanina es más predominante. Dicha posición confiere especificidad de procesado. No se observan más estructuras específicas en las primeras posiciones de la proteína madura en organismos eucarióticos (Nielsen y col., 1997). Por lo tanto, un "mal" péptido señal puede promover más de una separación específica que da como resultado la expresión no homogénea de la proteína; es decir, la proteína se expresará con diferentes aminoácidos N-terminales.

Puesto que muchas proteínas están reguladas en condiciones fisiológicas, el uso de señales reguladoras naturales para la sobreexpresión en sistemas de mamíferos no es deseable. Por ejemplo, en dichos sistemas se usan promotores eficientes tales como CMV y SV40 para controlar la expresión de proteínas recombinantes de interés. De forma similar, el uso de péptidos señal efectivos tales como SV40 y hGH poli A para sobreexpresar proteínas recombinantes secretadas en lugar de sus contrapartidas endógenas sería ventajoso.

Se ha descrito que el péptido señal de la hormona de crecimiento humana (hGH) es eficaz para la secreción de proteínas intracelulares, ligadas a membrana y de proteínas secretadas a través de mecanismos diferentes a los gobernados por péptidos señal.

Por ejemplo, el documento WO26562 describe la secreción de la proteína intracelular icIL-1ra-Il mediante fusión del péptido señal de hGH con la secuencia de la icIL-1ra-Il. La invención se refiere a un proceso para la expresión recombinante de una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la icIL-1ra-Il natural en un sistema de expresión celular recombinante a través del uso de un vector que es una fusión del péptido señal de una proteína secretora humana, preferiblemente el péptido señal de 26 aminoácidos de la hGH, fusionado en un marco de lectura apropiado con el ADN que codifica icIL-1ra-Il. El proceso comprende la producción de un vector de expresión que contienen ADN que codifica icIL-1ra-Il, bien en forma de ADNc o de ADN genómico, fusionado en un marco de lectura apropiado con el ADN que codifica el péptido señal seleccionado, preferiblemente el péptido señal de hGH de 26 aminoácidos (Figura 1, SEC ID Nº: 2). A continuación, el vector de expresión es insertado en un hospedante de expresión apropiado, tal como células CHO. Las células de hospedante transformadas son cultivadas a continuación de tal modo que se provoca que el vector de expresión exprese su proteína codificada, y entonces la proteína icIL-1ra-Il expresada y secretada es recolectada del medio de cultivo y purificada.

Morris y col. (1999) describen el uso de péptido señal de hGH para la secreción de la proteína CDL40L, que existe en la naturaleza predominantemente como molécula anclada a membrana. Varios informes han demostrado que la forma soluble de la CD40L es biológicamente activa (Fanslow y col., 1994, Hollenbaugh y col., 1992 y Mazzei y col., 1995). Para usar CD40L como agente terapéutico potencial se ha desarrollado la optimización de formas solubles de esta molécula. En este trabajo, se ha comparado la actividad de las formas solubles de CD40L con la actividad de la región homóloga de TNF de CD40L multimerizada soluble. Las formas solubles de CD40L han sido preparadas mediante fusión del dominio extracelular completo de CD40L humano o de la región de CD40L homóloga a la secuencia de TNF a la secuencia de péptido señal de hGH. La forma multimerizada de CD40L se ha preparado mediante fusión a un compresor de isoleucina (IZ, del inglés "isoleucine zipper"). Los resultados demostraron que la multimerización aumenta la actividad de CD40L soluble.

Pecceu y col. (1991) describen el uso del péptido señal de hGH para expresar y secretar la forma madura de IL-1ß. En el organismo, tras su síntesis, la proIL-1ß permanece principalmente citosólica hasta que es liberada y transportada fuera de las células. Un examen de la secuencia revela la ausencia de un péptido señal hidrofóbico N-terminal o interno clásico. La liberación de IL-1ß madura parece estar relacionada con el procesamiento en la ruptura de péptido de ácido aspártico-alanina por la enzima convertidora (ICE) (Dinarello, 1996). Aunque la ICE se expresa constitutivamente en la mayoría de las células, no todas las células procesan proIL-1ß y secretan IL-1ß madura. Por lo tanto, la secreción de IL-1ß madura es dependiente del tipo de célula. Pecceu describe el uso de un vector recombinante que contiene únicamente el ADN que codifica la forma madura de la IL-1ß, sin ningún péptido señal y un vector que contiene el ADN que codifica la forma madura de la IL-1ß, unido al péptido señal de hGH. Los resultados demuestran que sólo el 52% de la proteína es secretada usando la primera construcción, mientras que usando la construcción con el péptido señal de hGH se obtiene una secreción del 97%.

El primer codón ATG para el inicio de la traducción debe ser identificado por la maquinaria transcripcional. Un codón ATG en un contexto muy débil probablemente no sea la posición de inicio de la traducción. El contexto óptimo para el inicio de la traducción en ARNm vertebral es un residuo G que sigue al codón ATG (posición +4 en la región de codificación) y una purina, preferiblemente A, tres nucleótidos por encima (-3 en la región no codificadora), esta secuencia de consenso se ha designado secuencia Kozak (Kozak, 1996, 1999). El ARN mensajero en el que el primer codón ATG carece de los nucleótidos preferidos en estas dos posiciones de flanqueo claves (una secuencia "mala" o no óptima Kozak) tiene la propiedad especial de iniciar la traducción en el primer y segundo codones, produciendo con ello dos proteína a partir de un ARN. El ATG...

1. Un método in vitro para producir una proteína IL-18BP recombinante en un sistema de mamífero que se caracteriza porque

(i) dicha proteína IL-18BP recombinante exhibe homogeneidad de aminoácidos N-terminal; y

(ii) dicho método comprende la etapa de reemplazar la secuencia endógena de péptido señal del ADN que codifica dicha proteína IL-18BP por la del péptido señal de hormona de crecimiento humana (hGH).

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sistema de mamífero comprende células CHO.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que las células CHO son cultivadas en medio suplementado con suero.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que las células CHO son cultivadas en condiciones libres de suero.

5. El uso de un vector de expresión para producir in vitro una proteína IL-18BP recombinante en un sistema de mamífero, que se caracteriza porque

(i) dicha proteína IL-18BP recombinante exhibe homogeneidad de aminoácidos N-terminales; y

(ii) dicho vector comprende el ADN que codifica dicha proteína IL-18BP fusionada en un marco de lectura apropiado con el ADN que codifica la secuencia de péptido señal de hGH.

6. El uso de un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, que permite la expresión constitutiva de la proteína IL-18BP.

7. El uso de un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la expresión del gen que codifica la proteína IL-18BP está regulada por el promotor de CMV.

8. El uso de un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la expresión del gen que codifica la proteína IL-18BP está regulada por la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana.

9. Una célula que produce al menos 4 picogramos de IL-18BP/célula/24 horas, en la que dicha célula aloja un vector de expresión que comprende el ADN que codifica dicha proteína IL-18BP fusionada en un marco de lectura apropiado con el ADN que codifica la secuencia de péptido señal de hGH.

10. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9, que produce aproximadamente 12 picogramos de IL-18BP/célu- la/24 horas.

11. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9, que produce al menos 11,8 picogramos de IL-18BP/célula/24 horas.

12. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9, capaz de crecer en medio libre de suero.

13. Una célula de acuerdo con la reivindicación 12, que produce aproximadamente 12 picogramos de IL-18BP/célu- la/24 horas.

14. Una célula de acuerdo con la reivindicación 12, que produce 11,8 picogramos de IL-18BP/célula/24 horas.

15. Una célula de acuerdo con la reivindicación 12, que produce al menos 11,8 picogramos de IL-18BP/célula/24 horas.