CEPAS DE LEVADURA CAPACES DE SECRETAR BETA-GALACTOSIDASA AL MEDIO Y SU USO PARA LA PRODUCCION DE BIOMASA, ETANOL, BETA-GALACTOSIDASA Y PROTEINAS DE INTERES.

La invención se relaciona con cepas de S.cerevisiae capaces de secretar beta-galactosidasa de origen heterólogo al medio de cultivo así como a métodos para la obtención de beta-galactosidasa usando dichas cepas y métodos para la producción de glucosa/galactosa,

biomasa y bioetanol mediante el cultivo de dichas cepas en medios ricos en lactosa. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para la expresión de proteínas recombinantes usando una composición rica en lactosa como medio de cultivo para los microorganismos productores de dicha proteína

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200701946.

Solicitante: UNIVERSIDADE DA CORUA.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: A CORUÑA.

Inventor/es: GONZALEZ SISO, MARIA ISABEL, BECERRA FERNANDEZ, MANUEL, CERDAN VILLANUEVA,MARIA ESPERANZA, PEREIRA RODRIGUEZ,ANGEL, FERNANDEZ LEIRO,RAFAEL.

Fecha de Solicitud: 11 de Julio de 2007.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 27 de Enero de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/18 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Levadura de panadería; Levadura de cerveza.
  • C12N15/62A
  • C12N15/81 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para levaduras.
  • C12P19/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Monosacáridos.
  • C12P21/02 C12P […] › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
  • C12P7/06 C12P […] › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Etanol como producto químico y no como bebida alcohólica.
  • C12R1/865 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Saccharomyces cerevisiae.

Clasificación PCT:

  • C12N1/19 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/56 C12N 15/00 […] › que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. amilasa, galactosidasa, lisozima.
  • C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12N15/81 C12N 15/00 […] › para levaduras.
  • C12P19/02 C12P 19/00 […] › Monosacáridos.
  • C12P21/02 C12P 21/00 […] › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
  • C12P7/06 C12P 7/00 […] › Etanol como producto químico y no como bebida alcohólica.
  • C12R1/865 C12R 1/00 […] › Saccharomyces cerevisiae.

Fragmento de la descripción:

Cepas de levadura capaces de secretar ß-galactosidasa al medio y su uso para la producción de biomasa, etanol, ß-galactosidasa y proteínas de interés.

Campo técnico de la invención

La invención se relaciona con métodos para la producción de ß-galactosidasa, biomasa, etanol y proteínas de interés usando cepas de S. cerevisiae modificadas para secretar ß-galactosidasa de origen heterólogo.

Antecedentes de la invención

Se denomina suero de leche al líquido remanente tras la precipitación y separación de la caseína de la leche durante la elaboración del queso. Este subproducto representa aproximadamente el 85-90% del volumen de la leche y retiene el 55% de sus nutrientes. Las tendencias actuales del mercado a nivel mundial indican un incremento paulatino de la producción de queso, que genera más de 115 millones de toneladas de suero líquido.

A pesar del gran valor nutritivo y aplicaciones tecnológicas de algunos componentes de este subproducto, así como de las numerosas investigaciones realizadas al respecto, en la actualidad, todavía no se ha desarrollado ningún tratamiento capaz de rentabilizar el tratamiento de las importantes cantidades de suero que se producen y se vierten cada ano, representando un importante problema medioambiental por su elevada carga orgánica (DBO = 30.000-60.000 ppm) (González Siso, M.I., 1996, Biores. Technol. 57:1-11; González Siso, M.I., 1999, Manual Universitario nº 12. Servicio de publicaciones Universidade da Coruña). Una central quesera que procese 100 Tm de leche por día produce efluentes con aproximadamente la misma carga orgánica que una ciudad de 55.000 habitantes (Sienkiewicz y Riedel, 1990, Verlag Th. Mann, Alemania).

Uno de los inconvenientes para utilizar el suero como sustrato de la fermentación alcohólica radica en que el número de microorganismos capaces de metabolizar directamente la lactosa a etanol es muy reducido (Moulin, G. y Galzy, P. 1984, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 1:347-374). Aunque existen cepas de levadura capaces de fermentar directamente la lactosa, por ejemplo, la cepa de Saccharomyces lactis descrita la patente rusa RU2059713, la levadura conocida de mayor capacidad fermentadora y ampliamente utilizada en la industria cervecera, S. cerevisiae, carece de lactosa permeasa (la función de este transportador de lactosa es controlar la entrada del azúcar en la célula) y de ß-galactosidasa intracelular con lo cual es incapaz de fermentar directamente la lactosa a etanol (Russel, I., 1986, Trends Biotech. 49:107-108; Castillo, 1990 en Yeast biotechnology and biocatalysis, pp. 297-320 Ed. Hubert Veractert, René de Mot, Marcel Dekker Inc. USA). Un objetivo de especial interés en biotecnología consiste en la construcción de cepas de S. cerevisiae capaces de utilizar la lactosa y, de este modo, conseguir que la levadura se desarrolle directamente sobre el suero de leche, produciendo etanol, biomasa o algún otro producto de interés (Rubio-Texeira, M., 2006, Biotrechnol. Adv. 24:212-225) contribuyendo a la depuración y utilización de éste producto.

Una de las primeras aproximaciones para fermentar la lactosa del suero de leche consistió en la hidrólisis del disacárido mediante la ß-galactosidasa de otros microorganismos y posterior fermentación por S. cerevisae (Champagne, C. P. y Goulet, J. 1988, Can. Ins. Food. Sci. Technol. 21:545-548). Este proceso se puede desarrollar en dos pasos o en uno sólo, con cultivos mixtos o con la enzima y la levadura coinmovilizadas (véase, por ejemplo, la solicitud de patente WO8103339). No obstante, cuando S. cerevisiae usa la mezcla de glucosa y galactosa como fuente de carbono, manifiesta un crecimiento diáuxico y baja producción de etanol (Porro, D. et al., 1992, Biotechnol. Letters, 14:1085-1088). Otra desventaja de estos procesos es el alto precio de la ß-galactosidasa (Sienkiewicz, T. y Riedel, C.L. 1990, Verlag Th. Mann, Alemania).

Con la ayuda de las técnicas de ADN recombinante se han podido construir, mediante diferentes estrategias, cepas de S. cerevisiae capaces de metabolizar lactosa. Así, Sreekrishna y Dickson (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82:7909-7913) consiguieron cepas de S. cerevisiae capaces de metabolizar la lactosa al transformar dicha levadura con un plásmido integrativo que contenía los genes LAC4 (ß-galactosidasa) y LAC12 (lactosa permeasa) de Kluyveromyces lactis, según se describe en las solicitudes de patente GB2178431 y EP0206571. Estos autores obtuvieron un transformante con varias copias en tándem de los genes en una localización inespecífica del genoma, pero este transformante presentó un crecimiento lento y un fenotipo inestable.

Muchas de las estrategias genéticas desarrolladas posteriormente se basaron en la hidrólisis extracelular de la lactosa. En la mayoría de los casos esto implica una lisis celular. Uno de estos intentos se basó en usar el gen lacZ clonado bajo el control de un promotor de S. cerevisiae inducible por galactosa (Porro, D. et al., 1992, Biotechnol. Bioeng. 39:799-805). Las cepas superproductoras de ß-galactosidasa intracelular fueron capaces de crecer en lactosa debido a un cierto grado de lisis celular que liberó suficiente enzima para producir la hidrólisis extracelular del azúcar. La lisis celular fue provocada por la sobreexpresión del activador transcripcional de levaduras (GAL4). En otros casos la liberación de ß-galactosidasa intracelular fue mediante permeabilización con tolueno (Compagno, C. et al., 1993, Biotechnol. Bioeng. 42:398- 400) o mediante el uso de mutantes de S. cerevisiae que lisan a temperaturas no permisivas (Becerra, M. et al., 2004, J. Biotechnol. 109:131-137). La utilización de mutantes autolíticos es conveniente para aquellos casos en los que se necesita recuperar de las células un determinado producto al final del proceso fermentativo.

Relacionado con la utilización de mutantes de S. cerevisiae también se ha estudiado la utilidad de mutantes supersecretores y deficientes en proteasas transformados con la ß-galactosidasa de K. lactis (Becerra, M. et al., 2001, Biotechnol. Lett. 23:33-40, Becerra et al., 2002, Biotechnol. Lett. 24:1391-1396). Una aproximación alternativa consistió en el uso del gen de la ß-galactosidasa extracelular de Aspergillus niger expresado en S. cerevisiae (Kumar, V. et al., 1992, Bio/Technology, 10:82-85; Ramakrishnan, S. y Hartley, B.S., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59:4230-4235; Domingues, L. et al., 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:645-650 y WO9010703). La levadura transformada secretó un 40% al medio de cultivo en los primeros casos y creció en permeado de lactosuero.

En una aproximación más reciente (Rubio-Texeira, M. et al., 1998, Yeast, 14:827-837; Adam, A.C. et al., 1999, Yeast, 15:1299-1305; Domingues, L. et al., 1999, Appl. Microbiol. Biotechnol., 51:621-626, Domingues, L. et al., 1999, Biotechnol. Bioeng. 64:692-697 y Domingues, L, et al. 2001, Biotechnol. Bioeng., 72:507-514; Jurascik, M. et al., 2006, Biotechnol. Bioeng., 94:1147-1154; Rubio-Texeira, M. et al., 2006, Biotechnol. Adv. 24:212-225) se obtuvo una cepa diploide de S. cerevisiae capaz de metabolizar la lactosa por construcción, primero, de cepas haploides con múltiples integraciones en la región codificadora del ribosómico (locus RDN1) de los genes LAC4 y LACZ bajo el control de un promotor inducible por galactosa. Las cepas resultantes se cruzaron con una cepa silvestre, seleccionando dos cepas cruzadas de mating opuesto y fusionándolas para obtener un diploide de crecimiento rápido y Lac+. Sin embargo, la incorporación de la lactosa por la lactosa permeasa limita la hidrólisis intracelular de este disacárido (Rubio-Texeira, M. et al., 2000, J. Biotechnol., 84:97-106).

Otra aproximación consistió en el uso de una cepa de S. cerevisiae transformada con un plásmido que contenía el gen de la ß-galactosidasa de Escherichia coli (lacl) fusionado a la secuencia señal de secreción del gen de la glucoamilasa II (Vanoni et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun., 164: 1331-1338; Porro, D. et al., 1992, Biotechnol. Left., 14:1085-1088). A pesar de conseguir un porcentaje de secreción de la enzima de hasta un 70% en el espacio periplásmico, lo que permitía la hidrólisis de la lactosa extracelular y su utilización por las células, la velocidad de crecimiento fue muy lenta. Becerra, M. et al (Protein Engineering, 2001, 14: 379-386) han descrito cepas de S. cerevisiae transformadas con un...

 


Reivindicaciones:

1. Una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende

(i) una ß-galactosidasa seleccionada del grupo de
a)una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1 b)una variante funcionalmente equivalente de la proteína según (a) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dicha secuencia y (ii) una secuencia señal heteróloga en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la ß-galactosidasa de una célula de levadura.

2. La construcción de la reivindicación 1 en la que la secuencia señal comprende la secuencia señal del preprofactor a de S. cerevisiae.

3. La construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 caracterizada porque comprende, adicionalmente, un promotor que permite la expresión de la proteína de fusión.

4. La construcción según la reivindicación 3 en la que el promotor que está sujeto a represión en presencia de glucosa.

5. La construcción según la reivindicación 4 en la que el promotor es el promotor del gen ADH2.

6. La construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada porque comprende, adicionalmente, un terminador transcripcional.

7. La construcción según la reivindicación 6 en la que el terminador transcripcional es el terminador del gen CYC1.

8. Un vector plasmídico que contiene una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una proteína de fusión codificada por una construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Una cepa de levadura que contiene una construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un vector según la reivindicación 8 o una proteína de fusión según la reivindicación 9.

11. Un método para producir ß-galactosidasa que comprende las etapas de

(i) cultivar una cepa de levadura que contiene una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una ß-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la ß-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la ß-galactosidasa de una célula de levadura y
(ii) recuperar la ß-galactosidasa del medio de cultivo,
quaden donde la ß-galactosidasa se selecciona del grupo de a)una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1 b)una variante funcionalmente equivalente de la proteína según (a) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dicha secuencia.

12. Un método para obtener glucosa y/o galactosa que comprende las etapas de

(i) cultivar una cepa de levadura en un medio rico en lactosa, en donde dicha cepa comprende una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una ß-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la ß-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la ß-galactosidasa de una célula de levadura y
(ii) recuperar la glucosa y/o la galactosa del medio de cultivo,
quaden donde la ß-galactosidasa se selecciona del grupo de a)una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1 b)una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y c)una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (a) o (b) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias.

13. Un método para obtener un producto de fermentación que comprende las etapas de

(i) cultivar una cepa de levadura en un medio rico en lactosa, en donde dicha cepa comprende una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una ß-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la ß-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la ß-galactosidasa de una célula de levadura y
(ii) recuperar el producto de fermentación del medio de cultivo,
quaden donde la ß-galactosidasa se selecciona del grupo de a)una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1 b)una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y c)una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (a) o (b) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias.

14. Un método según la reivindicación 13 en el que el producto de fermentación es etanol.

15. Un método para obtener biomasa que comprende las etapas de

(i) cultivar una cepa de levadura en un medio rico en lactosa, en donde dicha cepa comprende una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende una ß-galactosidasa y una secuencia señal heteróloga fusionada con la ß-galactosidasa en el mismo marco de lectura en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la ß-galactosidasa de una célula de levadura y
(ii) recuperar la biomasa del medio de cultivo,
quaden donde la ß-galactosidasa se selecciona del grupo de 1.una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1 2.una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y 3.una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (1) o (2) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias.

16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 en el que la secuencia señal heteróloga codificada por la construcción de ADN comprende la secuencia señal del preprofactor a de S. cerevisiae.

17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 en el que la construcción de ADN contiene, adicionalmente, un promotor que permite la expresión de la proteína de fusión.

18. Un método según la reivindicación 17 en el que el promotor está sujeto a represión en presencia de glucosa.

19. Un método según la reivindicación 18 en el que el promotor es el promotor del gen ADH2.

20. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19 en el que la construcción de ADN contiene, adicionalmente, un terminador transcripcional.

21. Un método según la reivindicación 20 en el que el terminador transcripcional es el terminador del gen CYC1.

22. Un método según las reivindicaciones 11 a 21 en donde la composición rica en lactosa es suero de leche o permeado de suero de leche.

23. Una célula de levadura que comprende

(i) una primera construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende
a.una ß-galactosidasa seleccionada del grupo de 1.una proteína que comprende los aminoácidos 20 a 1006 de la proteína de SEQ ID NO:1 2.una proteína que comprende los aminoácidos 1 a 1025 de la proteína de SEQ ID NO:2 y 3.una variante funcionalmente equivalente de las proteínas según (1) o (2) que muestra una identidad en su secuencia aminoacídica de al menos un 70% con dichas secuencias. b.una secuencia señal heteróloga en donde dicha secuencia señal es capaz de promover la secreción de la ß-galactosidasa de una célula de levadura (ii) una segunda construcción de ADN que codifica para una proteína de interés operativamente acoplada a un promotor que permite la expresión de dicha proteína en levadura.

24. Una célula de levadura según la reivindicación 23 en la que la secuencia señal heteróloga codificada por la construcción de ADN comprende la secuencia señal del preprofactor a de S. cerevisiae.

25. Una célula de levadura según las reivindicaciones 23 ó 24 en la que la construcción de ADN contiene, adicionalmente, un promotor que permite la expresión de la proteína de fusión.

26. Una célula de levadura según la reivindicación 25 en el que el promotor está sujeto a represión en presencia de glucosa.

27. Una célula de levadura según la reivindicación 26 en el que el promotor es el promotor del gen ADH2.

28. Una célula de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27 en la que la construcción de ADN contiene, adicionalmente, un terminador transcripcional.

29. Una célula de levadura según la reivindicación 28 en la que el terminador transcripcional es el terminador del gen CYC 1.

30. Un método para la obtención de proteínas heterólogas que comprende las etapas de

a. cultivar al menos una célula de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29 en un medio rico en lactosa
b. recuperar la proteína heteróloga del medio.

31. Un método según la reivindicación 30 en el que el medio rico en lactosa es suero de leche.


 

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