La invención se relaciona con cepas de S.cerevisiae capaces de secretar beta-galactosidasa de origen heterólogo al medio de cultivo así como a métodos para la obtención de beta-galactosidasa usando dichas cepas y métodos para la producción de glucosa/galactosa,

biomasa y bioetanol mediante el cultivo de dichas cepas en medios ricos en lactosa. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para la expresión de proteínas recombinantes usando una composición rica en lactosa como medio de cultivo para los microorganismos productores de dicha proteína

Cepas de levadura capaces de secretar ß-galactosidasa al medio y su uso para la producción de biomasa, etanol, ß-galactosidasa y proteínas de interés.

Campo técnico de la invención

La invención se relaciona con métodos para la producción de ß-galactosidasa, biomasa, etanol y proteínas de interés usando cepas de S. cerevisiae modificadas para secretar ß-galactosidasa de origen heterólogo.

Antecedentes de la invención

Se denomina suero de leche al líquido remanente tras la precipitación y separación de la caseína de la leche durante la elaboración del queso. Este subproducto representa aproximadamente el 85-90% del volumen de la leche y retiene el 55% de sus nutrientes. Las tendencias actuales del mercado a nivel mundial indican un incremento paulatino de la producción de queso, que genera más de 115 millones de toneladas de suero líquido.

A pesar del gran valor nutritivo y aplicaciones tecnológicas de algunos componentes de este subproducto, así como de las numerosas investigaciones realizadas al respecto, en la actualidad, todavía no se ha desarrollado ningún tratamiento capaz de rentabilizar el tratamiento de las importantes cantidades de suero que se producen y se vierten cada ano, representando un importante problema medioambiental por su elevada carga orgánica (DBO = 30.000-60.000 ppm) (González Siso, M.I., 1996, Biores. Technol. 57:1-11; González Siso, M.I., 1999, Manual Universitario nº 12. Servicio de publicaciones Universidade da Coruña). Una central quesera que procese 100 Tm de leche por día produce efluentes con aproximadamente la misma carga orgánica que una ciudad de 55.000 habitantes (Sienkiewicz y Riedel, 1990, Verlag Th. Mann, Alemania).

Uno de los inconvenientes para utilizar el suero como sustrato de la fermentación alcohólica radica en que el número de microorganismos capaces de metabolizar directamente la lactosa a etanol es muy reducido (Moulin, G. y Galzy, P. 1984, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 1:347-374). Aunque existen cepas de levadura capaces de fermentar directamente la lactosa, por ejemplo, la cepa de Saccharomyces lactis descrita la patente rusa RU2059713, la levadura conocida de mayor capacidad fermentadora y ampliamente utilizada en la industria cervecera, S. cerevisiae, carece de lactosa permeasa (la función de este transportador de lactosa es controlar la entrada del azúcar en la célula) y de ß-galactosidasa intracelular con lo cual es incapaz de fermentar directamente la lactosa a etanol (Russel, I., 1986, Trends Biotech. 49:107-108; Castillo, 1990 en Yeast biotechnology and biocatalysis, pp. 297-320 Ed. Hubert Veractert, René de Mot, Marcel Dekker Inc. USA). Un objetivo de especial interés en biotecnología consiste en la construcción de cepas de S. cerevisiae capaces de utilizar la lactosa y, de este modo, conseguir que la levadura se desarrolle directamente sobre el suero de leche, produciendo etanol, biomasa o algún otro producto de interés (Rubio-Texeira, M., 2006, Biotrechnol. Adv. 24:212-225) contribuyendo a la depuración y utilización de éste producto.

Una de las primeras aproximaciones para fermentar la lactosa del suero de leche consistió en la hidrólisis del disacárido mediante la ß-galactosidasa de otros microorganismos y posterior fermentación por S. cerevisae (Champagne, C. P. y Goulet, J. 1988, Can. Ins. Food. Sci. Technol. 21:545-548). Este proceso se puede desarrollar en dos pasos o en uno sólo, con cultivos mixtos o con la enzima y la levadura coinmovilizadas (véase, por ejemplo, la solicitud de patente WO8103339). No obstante, cuando S. cerevisiae usa la mezcla de glucosa y galactosa como fuente de carbono, manifiesta un crecimiento diáuxico y baja producción de etanol (Porro, D. et al., 1992, Biotechnol. Letters, 14:1085-1088). Otra desventaja de estos procesos es el alto precio de la ß-galactosidasa (Sienkiewicz, T. y Riedel, C.L. 1990, Verlag Th. Mann, Alemania).

Con la ayuda de las técnicas de ADN recombinante se han podido construir, mediante diferentes estrategias, cepas de S. cerevisiae capaces de metabolizar lactosa. Así, Sreekrishna y Dickson (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82:7909-7913) consiguieron cepas de S. cerevisiae capaces de metabolizar la lactosa al transformar dicha levadura con un plásmido integrativo que contenía los genes LAC4 (ß-galactosidasa) y LAC12 (lactosa permeasa) de Kluyveromyces lactis, según se describe en las solicitudes de patente GB2178431 y EP0206571. Estos autores obtuvieron un transformante con varias copias en tándem de los genes en una localización inespecífica del genoma, pero este transformante presentó un crecimiento lento y un fenotipo inestable.

Muchas de las estrategias genéticas desarrolladas posteriormente se basaron en la hidrólisis extracelular de la lactosa. En la mayoría de los casos esto implica una lisis celular. Uno de estos intentos se basó en usar el gen lacZ clonado bajo el control de un promotor de S. cerevisiae inducible por galactosa (Porro, D. et al., 1992, Biotechnol. Bioeng. 39:799-805). Las cepas superproductoras de ß-galactosidasa intracelular fueron capaces de crecer en lactosa debido a un cierto grado de lisis celular que liberó suficiente enzima para producir la hidrólisis extracelular del azúcar. La lisis celular fue provocada por la sobreexpresión del activador transcripcional de levaduras (GAL4). En otros casos la liberación de ß-galactosidasa intracelular fue mediante permeabilización con tolueno (Compagno, C. et al., 1993, Biotechnol. Bioeng. 42:398- 400) o mediante el uso de mutantes de S. cerevisiae que lisan a temperaturas no permisivas (Becerra, M. et al., 2004, J. Biotechnol. 109:131-137). La utilización de mutantes autolíticos es conveniente para aquellos casos en los que se necesita recuperar de las células un determinado producto al final del proceso fermentativo.

Relacionado con la utilización de mutantes de S. cerevisiae también se ha estudiado la utilidad de mutantes supersecretores y deficientes en proteasas transformados con la ß-galactosidasa de K. lactis (Becerra, M. et al., 2001, Biotechnol. Lett. 23:33-40, Becerra et al., 2002, Biotechnol. Lett. 24:1391-1396). Una aproximación alternativa consistió en el uso del gen de la ß-galactosidasa extracelular de Aspergillus niger expresado en S. cerevisiae (Kumar, V. et al., 1992, Bio/Technology, 10:82-85; Ramakrishnan, S. y Hartley, B.S., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59:4230-4235; Domingues, L. et al., 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:645-650 y WO9010703). La levadura transformada secretó un 40% al medio de cultivo en los primeros casos y creció en permeado de lactosuero.

En una aproximación más reciente (Rubio-Texeira, M. et al., 1998, Yeast, 14:827-837; Adam, A.C. et al., 1999, Yeast, 15:1299-1305; Domingues, L. et al., 1999, Appl. Microbiol. Biotechnol., 51:621-626, Domingues, L. et al., 1999, Biotechnol. Bioeng. 64:692-697 y Domingues, L, et al. 2001, Biotechnol. Bioeng., 72:507-514; Jurascik, M. et al., 2006, Biotechnol. Bioeng., 94:1147-1154; Rubio-Texeira, M. et al., 2006, Biotechnol. Adv. 24:212-225) se obtuvo una cepa diploide de S. cerevisiae capaz de metabolizar la lactosa por construcción, primero, de cepas haploides con múltiples integraciones en la región codificadora del ribosómico (locus RDN1) de los genes LAC4 y LACZ bajo el control de un promotor inducible por galactosa. Las cepas resultantes se cruzaron con una cepa silvestre, seleccionando dos cepas cruzadas de mating opuesto y fusionándolas para obtener un diploide de crecimiento rápido y Lac⁺. Sin embargo, la incorporación de la lactosa por la lactosa permeasa limita la hidrólisis intracelular de este disacárido (Rubio-Texeira, M. et al., 2000, J. Biotechnol., 84:97-106).

Otra aproximación consistió en el uso de una cepa de S. cerevisiae transformada con un plásmido que contenía el gen de la ß-galactosidasa de Escherichia coli (lacl) fusionado a la secuencia señal de secreción del gen de la glucoamilasa II (Vanoni et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun., 164: 1331-1338; Porro, D. et al., 1992, Biotechnol. Left., 14:1085-1088). A pesar de conseguir un porcentaje de secreción de la enzima de hasta un 70% en el espacio periplásmico, lo que permitía la hidrólisis de la lactosa extracelular y su utilización por las células, la velocidad de crecimiento fue muy lenta. Becerra, M. et al (Protein Engineering, 2001, 14: 379-386) han descrito cepas de S. cerevisiae transformadas con un...

1. Una construcción de ADN que codifica para una proteína de fusión que comprende

2. La construcción de la reivindicación 1 en la que la secuencia señal comprende la secuencia señal del preprofactor a de S. cerevisiae.

3. La construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 caracterizada porque comprende, adicionalmente, un promotor que permite la expresión de la proteína de fusión.

4. La construcción según la reivindicación 3 en la que el promotor que está sujeto a represión en presencia de glucosa.

5. La construcción según la reivindicación 4 en la que el promotor es el promotor del gen ADH2.

6. La construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizada porque comprende, adicionalmente, un terminador transcripcional.

7. La construcción según la reivindicación 6 en la que el terminador transcripcional es el terminador del gen CYC1.

8. Un vector plasmídico que contiene una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una proteína de fusión codificada por una construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Una cepa de levadura que contiene una construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un vector según la reivindicación 8 o una proteína de fusión según la reivindicación 9.

11. Un método para producir ß-galactosidasa que comprende las etapas de

12. Un método para obtener glucosa y/o galactosa que comprende las etapas de

13. Un método para obtener un producto de fermentación que comprende las etapas de

14. Un método según la reivindicación 13 en el que el producto de fermentación es etanol.

15. Un método para obtener biomasa que comprende las etapas de

16. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 en el que la secuencia señal heteróloga codificada por la construcción de ADN comprende la secuencia señal del preprofactor a de S. cerevisiae.

17. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16 en el que la construcción de ADN contiene, adicionalmente, un promotor que permite la expresión de la proteína de fusión.

18. Un método según la reivindicación 17 en el que el promotor está sujeto a represión en presencia de glucosa.

19. Un método según la reivindicación 18 en el que el promotor es el promotor del gen ADH2.

20. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 19 en el que la construcción de ADN contiene, adicionalmente, un terminador transcripcional.

21. Un método según la reivindicación 20 en el que el terminador transcripcional es el terminador del gen CYC1.

22. Un método según las reivindicaciones 11 a 21 en donde la composición rica en lactosa es suero de leche o permeado de suero de leche.

23. Una célula de levadura que comprende

24. Una célula de levadura según la reivindicación 23 en la que la secuencia señal heteróloga codificada por la construcción de ADN comprende la secuencia señal del preprofactor a de S. cerevisiae.

25. Una célula de levadura según las reivindicaciones 23 ó 24 en la que la construcción de ADN contiene, adicionalmente, un promotor que permite la expresión de la proteína de fusión.

26. Una célula de levadura según la reivindicación 25 en el que el promotor está sujeto a represión en presencia de glucosa.

27. Una célula de levadura según la reivindicación 26 en el que el promotor es el promotor del gen ADH2.

28. Una célula de levadura según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27 en la que la construcción de ADN contiene, adicionalmente, un terminador transcripcional.

29. Una célula de levadura según la reivindicación 28 en la que el terminador transcripcional es el terminador del gen CYC 1.

30. Un método para la obtención de proteínas heterólogas que comprende las etapas de

31. Un método según la reivindicación 30 en el que el medio rico en lactosa es suero de leche.