Vector de adenovirus recombinante que comprende elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo,

en el que dicho vector comprende además una secuencia que codifica para una proteína E4-orf6 funcional, en el que dicha secuencia se selecciona del grupo que consiste en:

a) una secuencia que codifica para E4-orf6 de un adenovirus de un segundo serotipo diferente de dicho primer serotipo; y b) una secuencia que codifica para E4-orf6 que comprende una fusión entre una parte de una secuencia que codifica para E4-orf6 de un segundo serotipo diferente de dicho primer serotipo y una parte de una secuencia que codifica para E4-orf6 de un tercer serotipo, en el que dicho tercer serotipo puede ser idéntico a o diferente de dicho primer serotipo

Medios y métodos para la producción de vectores de adenovirus.

Campo de la invención

La invención se refiere a vehículos de suministro de ácido nucleico y al uso de los mismos, más en particular la invención se refiere a vectores adenovirales recombinantes y al uso de los mismos.

Antecedentes de la invención

Hasta la fecha se han identificado 51 serotipos de adenovirus humanos que se subdividen en 6 subgrupos (A, B, C, D, E y F) basándose en las propiedades de hemaglutinación y homología de secuencia (Francki et al., 1991). El ciclo infeccioso de los adenovirus se divide en una fase temprana y una tardía. En la fase temprana, el virus no está recubierto y el genoma se transporta al núcleo tras lo cual las regiones génicas tempranas (E1, E2, E3 y E4) se vuelven transcripcionalmente activas. La región E1 contiene dos regiones de transcripción: E1A y E1B. E1A codifica para proteínas que están implicadas en la modificación del ciclo de células huésped y la activación de las demás regiones de transcripción virales (revisado por Rusell. 2000). La región E1B codifica para dos proteínas principales: E1B-19K y E1B-55K, que evitan la inducción de apoptosis que resulta de la actividad de las proteínas E1A (Rao et al., 1992; Yew y Berk 1992; Shenk 1996). Además, se requiere la proteína E1B-55K en la fase tardía para el transporte de ARNm viral selectivo y la inhibición de la expresión de proteínas huésped (Pilder et al., 1986). E2 se divide también en dos subdominios: E2A y E2B, que juntos codifican para tres proteínas (una proteína de unión a ADN, una polimerasa viral y una proteína pre-terminal), que están todas implicadas en la replicación del genoma viral (Van der Vliet 1995). E3 no es necesaria para la replicación in vitro pero codifica para varias proteínas que debilitan el mecanismo de defensa del huésped frente a la infección viral (Horwitz 2001). E4 porta al menos 6 marcos de lectura abiertos (orf) que codifican para proteínas implicadas en varias funciones distintas relacionadas con el corte y empalme y transporte de ARNm viral, transporte de ARNm de células huésped, transcripción y transformación viral y celular (revisado por Leppard 1997). Las proteínas tardías, necesarias para la formación de las cápsidas virales y el empaquetamiento de los genomas virales, se generan todas a partir de la unidad de transcripción tardía principal (MLTU) que se vuelve completamente activa después del inicio de la replicación. Un proceso complejo de corte y empalme diferencial y poliadenilación da origen a más de 15 especies de ARNm que comparten una secuencia líder tripartita. Las proteínas E1B-55K, E4-crf3 y E4-orf6 desempeñan un papel fundamental en la regulación del procesamiento y transporte de ARNm viral tardío desde el núcleo. Para este proceso E1B-55K interactúa con E4-orf6 para formar un complejo funcional que estimula el transporte de moléculas de ARNm virales al citoplasma, mientras que el complejo está también implicado en la inhibición del transporte de ARNm celulares del núcleo al citoplasma (revisado por Leppard 1997 y 1998).

La producción de vectores con deleción de E1 basándose en serotipos Ad5 o Ad2 del subgrupo C se logra en líneas celulares de complementación E1 tales como 293 (Graham et al., 1970), 911 (Fallaux et al., 1996) y PER.C6^TM (Fallaux et al., 1998; N.º de depósito ECACC 96022940). Tal como se da a conocer en el documento WO 99/55132 y el documento WO 01/05945, los vectores y las líneas celulares pueden aparearse para evitar la generación de adenovirus competentes en replicación a través de recombinación homóloga entre secuencias de adenovirus en la línea celular y el vector. Para una producción eficiente de adenovirus incompetentes en replicación derivados del grupo C, se usa preferiblemente la línea celular PER.C6^TM. Usando esta línea celular pueden aparearse los vectores de adenovirus, permitiendo de esta manera la producción de vectores adenovirales de grupo C en ausencia de adenovirus competentes en replicación (Fallaux et al., 1998; patente de los EE.UU. N.º 6.033.908). Sin embargo, los vectores del grupo C podrían no siempre ser los vehículos ideales para aplicaciones in vivo directas puesto que la eficacia de infección está afectada seriamente por la presencia de altos títulos de actividad neutralizante en la mayoría de los seres humanos y la ausencia de cantidades suficientes del receptor celular (receptor de adenovirus de Coxsackie, CAR) en células diana primarias específicas (por ejemplo células endoteliales, células de músculo liso, sinoviocitos, monocitos y células dendríticas). La administración de cantidades más altas de virus para aumentar la transducción puede llevar a toxicidad aumentada y a un resultado clínico impredecible debido a la variación en los títulos neutralizantes de los sujetos que se tratan. Estas limitaciones pueden ser superadas por el uso de otros serotipos de adenovirus. Por ejemplo, la parte de unión a receptor de una fibra de virus de subgrupo B (en particular del serotipo 16) cuando se expresa en un vector basado en Ad5, media una infección significativamente aumentada de células endoteliales y células de músculo liso humanas (documento WO 00/31285) y de sinoviocitos humanos (documento WO 00/52186). La fibra de otro adenovirus de subgrupo B, Ad35, es más eficaz para mediar la infección de monocitos humanos y células dendríticas (documento WO 00/03029). Además, se ha identificado Ad35 como un virus para el cual la vasta mayoría de la población humana no tiene actividad neutralizante (documento WO 00/70071).

Existe una necesidad generalmente sentida en la técnica por desarrollar tecnología que tenga una utilidad de serotipo más amplia. Un problema particular es la falta de líneas celulares de empaquetamiento adecuadas para estos otros serotipos. Las líneas celulares de empaquetamiento para vectores Ad5 comprenden normalmente proteínas codificadas E1 derivadas del serotipo 5 de adenovirus. Ejemplos de estas líneas celulares de empaquetamiento patrón son 293, 911 y P3R.C6^TM. Los intentos por producir vectores derivados de otros serotipos en estas líneas celulares de empaquetamiento patrón han demostrado ser difíciles si no insatisfactorios. Ocasionalmente se observa cierta producción, dependiendo del serotipo particular usado. Sin embargo, los rendimientos de vectores de adenovirus recombinantes derivados de subgrupos de adenovirus que no son de subgrupo C, producidos en líneas celulares transformadas e inmortalizadas por E1 de Ad5, es deficiente. En un artículo de Abrahamsen et al., (1997), una purificación de placa mejorada de un vector de serotipo 7 de adenovirus con deleción de E1A (subgrupo B) se observó en células 293 que comprendían E4-orf6 derivada del serotipo 5 de adenovirus, en comparación con células 293 que carecían de la secuencia E4-orf6 de Ad5. Sin embargo, se encontró un problema con la estabilidad del vector ya que se observaron recombinaciones inesperadas en grupos purificados en placa. Un problema adicional se encontró con la contaminación de virus de adenovirus de tipo natural durante la producción. Además, para la producción a gran escala de adenovirus no es útil cotransfectar E4-orf6 para obtener títulos que sean lo suficientemente altas como para su aplicación. Una opción para el crecimiento de tales adenovirus es proporcionar células con el gen E4-orf6 integrado establemente en el genoma de la línea de células de complementación/empaquetamiento. Se han descrito tales células en la técnica (por ejemplo, el documento WO 96/22378). Una desventaja de ese sistema es el hecho de que han de generarse nuevas líneas celulares estables, y han de realizarse numerosas rondas de selección antes de que células estables y adecuadas se hayan generado. Este proceso es laborioso y requiere mucho tiempo. En general, puede decirse que la generación y propagación de adenovirus de serotipos diferentes del serotipo 5 (subgrupo C), tales como virus del subgrupo B, ha demostrado ser difícil en células de complementación Ad5. Se ha dado a conocer por los solicitantes en el documento WO 00/70071, que pueden hacerse virus recombinantes basándose en el virus de Ad35 del subgrupo B mediante la cotransfección de una construcción de expresión que contiene las secuencias de la región 1 temprana de Ad35 (Ad35-E1). Además, los virus basados en Ad35 que están delecionados solamente para las secuencias E1A y no para E1B mostraron replicarse eficazmente en células PER.C6, sugiriendo que las proteínas E1A de Ad5 son capaces de complementar las funciones de Ad35-E1A (solicitud internacional del solicitante PCT/NL01/00824)....

1. Vector de adenovirus recombinante que comprende elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, en el que dicho vector comprende además una secuencia que codifica para una proteína E4-orf6 funcional, en el que dicha secuencia se selecciona del grupo que consiste en:

2. Vector de adenovirus recombinante según la reivindicación 1, en el que dicho primer serotipo y dicho segundo serotipo son de diferentes subgrupos de adenovirus.

3. Vector de adenovirus recombinante según la reivindicación 1, en el que dicho primer serotipo es de un subgrupo diferente del subgrupo C, y en el que dicha secuencia que codifica para E4-orf6 es de un serotipo de adenovirus del subgrupo C.

4. Vector de adenovirus recombinante según la reivindicación 1, en el que dicho primer serotipo es del subgrupo B y dicho segundo serotipo es del subgrupo C.

5. Vector de adenovirus recombinante según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia que codifica para E4-orf6 es del serotipo 5 de adenovirus.

6. Vector de adenovirus recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho primer serotipo se selecciona del grupo que consiste en serotipos 11, 14, 16, 21, 34, 35 y 50 de adenovirus.

7. Vector de adenovirus recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además una secuencia que codifica para una proteína, polipéptido o péptido no adenoviral.

8. Vector de adenovirus recombinante según la reivindicación 7, en el que dicha proteína, dicho polipéptido o dicho péptido no adenoviral se selecciona del grupo que consiste en: un polipéptido inductor de muerte celular, un determinante antigénico de un organismo patógeno, un antígeno específico de tumor, una proteína viral, una hormona y una citocina.

9. Método para la producción de un vector de adenovirus recombinante que comprende elementos estructurales y no estructurales de un adenovirus de un primer serotipo, comprendiendo dicho método las etapas de:

en el que la secuencia que codifica para la proteína E4-orf6 compatible está presente en el vector de adenovirus recombinante producido de esta manera.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicha secuencia que codifica para E4-orf6 se selecciona del grupo que consiste en:

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que dicho primero y dicho segundo serotipos son de diferentes subgrupos.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho segundo serotipo es un serotipo de adenovirus del subgrupo C.

13. Método según la reivindicación 12, en el que dicho segundo serotipo es serotipo 5 de adenovirus.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que dicho primer serotipo es un serotipo de adenovirus del subgrupo B.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicho primer serotipo se selecciona del grupo que consiste en serotipos 11, 14, 16, 21, 34, 35 y 50 de adenovirus.

16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en el que dicha secuencia que codifica para E1B-55K está integrada en el genoma de dicha célula de complementación.

17. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16, en el que dicha célula de complementación se deriva de una célula humana diploide, primaria, o una célula progenitora de la misma.

18. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, en el que dicha célula de complementación se deriva de una célula de retinoblasto humano primaria, una célula de riñón embrionario humana primaria, una célula neuronal humana primaria o un amniocito humano primario.

19. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, en el que dicha célula de complementación comprende, integrado en su genoma, un ácido nucleico que codifica para al menos una proteína E1A de adenovirus.

20. Método según la reivindicación 19, en el que dicho ácido nucleico que codifica para al menos una proteína E1A de adenovirus es de un serotipo de adenovirus de un subgrupo diferente que el subgrupo B.

21. Método según la reivindicación 19, en el que dicho ácido nucleico que codifica para al menos una proteína E1A de adenovirus es de un serotipo de adenovirus del subgrupo C.

22. Método según la reivindicación 20, en el que dicho ácido nucleico que codifica para al menos una proteína E1A de adenovirus es de un serotipo 5 de adenovirus.

23. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 22, en el que dicha secuencia que codifica para E4-orf6 y dicha secuencia que codifica para E1B-55K son de serotipos de adenovirus diferentes y en el que dichos serotipos de adenovirus diferentes son miembros del mismo subgrupo de adenovirus.

24. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 22, en el que dicha secuencia que codifica para E4-orf6 y dicha secuencia que codifica para E1B-55K son de serotipos de adenovirus diferentes, y en el que dichos serotipos de adenovirus diferentes son ambos miembros del subgrupo C.

25. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 22, en el que dicha secuencia que codifica para E4-orf6 y dicha secuencia que codifica para E1B-55K son del mismo serotipo de adenovirus.

26. Método según la reivindicación 25, en el que dicha secuencia que codifica para E4-orf6 y dicha secuencia que codifica para E1B-55K son del serotipo 5 de adenovirus.

27. Método según la reivindicación 9, en el que dicha célula de complementación es una célula PER.C6 o un derivado de la misma.

28. Composición farmacéutica que comprende un vector adenoviral recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, u obtenible mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 27.

29. Kit de partes que comprende:

30. Kit de partes según la reivindicación 30, en el que dicha secuencia que codifica para E4-orf6 se selecciona del grupo que consiste en: