MEDIO DE CULTIVO DENOMINADO MV06 TANTO PARA CELULAS ENDOTELIALES COMO MIOCARDICAS.

Medio de cultivo denominado MV06 que permite el crecimiento in vitro tanto de células progenitoras endoteliales como de células progenitoras miocárdicas,

compuesto de:

- Medio de Dulbecco modificado de Iscove

- Suero fetal de ternera

- Suero de caballo

- L-glutamina 200 mM (100X)

- Penicilina (10000 u/ml)/estreptomicina (1000 µg/ml)

- Proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) hu-R

- Factor 2 de crecimiento de fibroblastos (FGF2) hu-R

- Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) hu-R

Medio de cultivo denominado MV06 tanto para células endoteliales como miocárdicas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un medio de cultivo denominado MV06 que permite el crecimiento in vitro tanto de células progenitoras endoteliales como miocárdicas, a partir de células CD34+.

Antecedentes de la invención

Para aplicaciones clínicas posteriores, es preciso proceder a una diferenciación y una expansión ex vivo de células progenitoras endoteliales y miocárdicas a partir de células CD34+ previamente purificadas mediante inmunoselección.

Una cuestión crucial es demostrar que la diferenciación dedicada y las capacidades funcionales de los subconjuntos de células CD34+ no se modificarían tras la expansión ex vivo.

Técnica anterior

En la bibliografía se han dado a conocer diversos medios de cultivo capaces de inducir una diferenciación in vitro de células madre adultas humanas en células endoteliales o en células del músculo cardiaco.

Para células endoteliales (EC), Hernández et al. han desarrollado un medio de cultivo que permite la diferenciación de células mononucleares (MNC), obtenidas a partir de aféresis sanguínea, en células endoteliales. Aquí, las MNC se cultivaron en gelatina o fibronectina en medio M199 suplementado con suero fetal de ternera (FCS), insulina, transferrina, suplemento para crecimiento de células endoteliales, y heparina. Las colonias de EC se desarrollaron en 6 de 7 cultivos a partir de MNC derivadas de leucaféresis. Las células desarrollaron una morfología de EC a 15,5 ± 2 días, con inmunotinción positiva con el factor de von Willebrand (vWF) y VEGFR-2.

Porat et al. también usaron MNC de sangre periférica humana para la diferenciación de células endoteliales tras el cultivo en medio X-VIVO15®, suplementado con suero autólogo, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y heparina. Las células denominadas "población celular sinergética" (SCP) se cultivaron durante 5 días en cápsulas revestidas previamente con fibronectina o plasma autólogo para generar precursores celulares angiogénicos (ACP). Los ACP expresaron CD34, CD133, VEGFR-2, Tie-2, CD144, vWF, CD31^Bright con la captación concomitante de lipoproteína de baja densidad acetilada (Ac-LDL), segregaron VEGF y formaron estructuras similares a tubos in vitro con un kit de ensayo de angiogénesis in vitro (Chemicon).

Endocult® es un medio comercializado por Stem Cells Technologies para generar CFU-células endoteliales (CFU-EC). Este medio permite la cuantificación de subpoblaciones de células madre endoteliales que circulan en sangre periférica (PB) o que existen en la médula ósea entre las MNC totales. Sin embargo, este método de cultivo parece que es inapropiado cuando se cultivan células CD34+ sanguíneas purificadas en lugar de MNC, puesto que sufren apoptosis después de 2 días solamente en estas condiciones de cultivo.

Por su parte, Peichev et al. identificaron precursores endoteliales circulantes que expresan CD34, VEGFR-2 y CD133 en PB humana, PB movilizada y en hígado fetal (1,2 ± 0,3%; 0,4 ± 0,2% y 2 ± 0,5% respectivamente). También tuvieron éxito induciendo una diferenciación endotelial significativa a partir de estas EPC usando medio M199 suplementado con suero fetal bovino (FBS), factor 2 de crecimiento de fibroblastos (FGF2), y heparina. Después de 3 días, las células no adherentes se transfirieron a cápsulas revestidas con colágeno, y se hicieron crecer en el mismo medio durante 2 semanas. El cultivo dio como resultado la diferenciación en células adherentes con colonias CD133-, VEGFR-2+ y Ac-LDL+, con una eficacia de cultivo en placas de 3%.

Para células del músculo cardiaco, sólo muy pocos grupos han desarrollado medios de cultivo que permiten la diferenciación in vitro de células madre adultas humanas en células del músculo cardiaco. Además de la diferenciación endotelial, el grupo de Porat también estaba interesado en diferenciar PB-MNC en células del músculo cardiaco, y usó un medio que contiene 5-azacitidina. Morfológicamente, los precursores de las células miocárdicas parecían alargados, expresaron troponina T cardiaca y conexina 43. El análisis mediante citometría de flujo mostró la expresión de desmina y troponina T cardiaca (en 19,7% y 52,3% de las células, respectivamente). Pero este método no promueve una diferenciación espontánea de las células madre, puesto que la 5-azacitidina es un agente mutágeno. Además, este mecanismo mutagénico también podría producir un uso clínico eventual adicional de células diferenciadas peligrosas.

Otra manera utilizada para la diferenciación in vitro de células madre adultas humanas en cardiomiocitos es cocultivar células madre con cardiomiocitos de ratones neonatos en cultivo primario. Yoon et al. usaron este método para inducir la diferenciación cardiaca de extirpes celulares de médula ósea humana (hBMSC). En el día tercero, las hBMSC se añadieron a los NRCM cultivados a una relación 1:4, y se cultivaron hasta 2 semanas. Las imágenes de inmunofluorescencia mostraron expresión de troponina 1 cardiaca, de péptido natriurético ventricular y de la cadena pesada de a-miosina. La expresión de ARNm de GATA4 y Nkx2-5 se detectó sólo después del cocultivo. Badorff et al. mezclaron células CD34+ humanas con NRCM aislados recientemente, en una relación 1:4, en un medio que contiene 10% de suero de caballo (HS) y 5% de FCS. Después de 2 días, el medio se cambió a 5% de HS durante 4 días. El 10% de las células CD34+ se diferenciaron en células positivas a a-actina sarcomérica. Sin embargo, tal cocultivo de células humanas y células de rata puede promover un mecanismo de fusión entre los dos tipos celulares, lo que hace inapropiado a tal método para el uso clínico potencial posterior. La prevalencia de la diferenciación y fusión se evaluó por Yoon et al. a 3,2 ± 0,9% y 2,9 ± 1,1%, respectivamente.

De este modo, incluso cuando se consideran todos estos ensayos de cultivo, nadie ha desarrollado actualmente un único medio que tenga la capacidad para inducir la diferenciación tanto de células endoteliales como de células del músculo cardiaco para las denominadas células madre hematopoyéticas, de una forma similar a lo que podría ocurrir tras la reinyección intramiocárdica de células.

Explicación de la invención

El medio de cultivo MV06, que permite el crecimiento in vitro de células progenitoras tanto endoteliales como miocárdicas, según la invención está compuesto de:

1. Medio de cultivo denominado MV06 que permite el crecimiento in vitro tanto de células progenitoras endoteliales como de células progenitoras miocárdicas, compuesto de: