Una línea celular eucariota estable que consiste esencialmente en CHO crelox-hERG UG

7, ATCC PTA-6812, o su progenie, derivados o descendientes

Líneas celulares estables que expresan hERG.

Esta invención está relacionada en general con unas líneas celulares estables que expresan el canal de potasio hERG activado por voltaje, y los métodos para utilizar dichas células para probar la capacidad de los compuestos de inhibir la corriente de hERG.

Los canales iónicos constituyen una clase relativamente pequeña de dianas farmacéuticas, en parte porque ha sido difícil la automatización de los ensayos de cribaje de los canales iónicos y su formato a gran escala. Sin embargo, avances recientes en electrofisiología (P.B. Bennett et al., Trends in Biotech (2003) 21(12):563-69; C. Wood et al., Fármaco Disc Today (2004) 9(10):434-41) han renovado el interés en los canales iónicos como dianas para el descubrimiento de fármacos. Varios canales iónicos se han relacionado con enfermedades hereditarias, lo que conduce a estudiar los moduladores de los canales iónicos para el tratamiento y prevención de enfermedades (D. Owen et al., Drug Disc World (2002) 48-61).

hERG es un canal iónico de particular interés para la industria farmacéutica, aunque más como un problema de seguridad/toxicológico que como diana para el desarrollo de moduladores (ICH S7B Guidance for Industry, Oct. 2005; J.I. Vandenberg et al., Trends Pharm Sci (2001) 22(5): 240-46). El canal de potasio activado por voltaje hERG contribuye a la corriente de potasio rectificadora tardía de rápida activación (IKr) del potencial de acción cardiaco. La interacción de fármacos con el canal de potasio hERG se ha visto implicada en la prolongación del intervalo QT del electrocardiograma y la arritmia cardiaca conocida como Torsades de Pointes ("TdP"; véase C.E. Chiang y D.M. Roden, J Am Coll Cardiol (2000) 36(1):1-12.; D.M. Roden, N Eng J Med (2004) 350:1013-22.). La TdP puede ser fatal, y el riesgo de inducirla conduce al abandono y a la falta de aprobación de productos farmacéuticos.

Se ha comprobado que el cribaje a gran escala de fármacos candidatos para determinar su posible efecto sobre hERG es difícil, en gran parte debido a la falta de disponibilidad de una línea celular estable que exprese hERG con la suficiente concentración en superficie, y que sea un sujeto adecuado para los instrumentos de medida del flujo iónico a gran escala.

Los inventores han creado líneas celulares que expresan hERG que de forma reproducible forma sellos estables con gran amplitud de la corriente utilizando análisis estándar y automatizados de control en parche (del inglés patch clamp). Las líneas celulares de la invención producen valores de CI₅₀ que son representativos de los que se han descrito en la bibliografía utilizando métodos a pequeña escala.

Un aspecto de la invención es una línea celular eucariota estable que expresa hERG, y muestra una corriente de prueba que varía en menos de aproximadamente un 20% de amplitud de la corriente del pico bajo las condiciones control durante alrededor de una hora.

Otro aspecto de la invención es un método para determinar la propensión de un compuesto de prueba a inhibir la actividad conductiva de hERG, poniéndose en contacto una célula de la invención con dicho compuesto de prueba, midiendo una corriente de prueba bajo condiciones electrofisiológicas, y determinando si la corriente de prueba es menor en presencia del compuesto de prueba.

Definiciones

A no ser que se indique de otro modo, los siguientes términos utilizados en esta solicitud, incluyendo la especificación y las reivindicaciones, tiene el significado que se proporciona a continuación. Debe notarse que, tal y como se utilizan en la especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen los referentes plurales a no ser que el contexto claramente los dicte de otro modo.

"Agonista" se refiere a un compuesto que potencia la actividad de otro compuesto o receptor.

"Antagonista" se refiere a un compuesto que disminuye o evita la acción de otro compuesto o receptor.

El término "fármaco candidato" se refiere a un compuesto o preparación del que se va a probar su posible efecto en el tratamiento de una enfermedad en un animal, independientemente de si dicho fármaco candidato posee una actividad biológica conocida.

El término "homólogo" como se utiliza aquí se refiere a una proteína que realiza sustancialmente la misma función en otra especie dada y comparte una identidad de secuencia sustancial, hasta el punto que se reconocen en el campo como versiones diferentes de la misma proteína, que difieren principalmente en la especie en la que se encuentran. Así, por ejemplo, el ERG humano, el ERG de ratón y el ERG de rata se consideran todos homólogos entre ellos.

"Modulador" significa una molécula que interacciona con una diana. Las interacciones incluyen, pero no se limitan a, un agonista, un antagonista y similares, como se definen aquí. "Enfermedad" significa cualquier enfermedad, estado, síntoma, trastorno o indicación.

El término "línea celular" se refiere a un clon de células de mamífero inmortalizadas. Una línea celular "estable" es una línea celular que muestra características sustancialmente consistentes a lo largo del tiempo (por ejemplo tras doblarse). Una línea celular estable dentro del alcance de esta invención proporciona una proporción sustancial de células que son capaces de ejercer una resistencia de sellado superior a alrededor de 50 MOhm, una amplitud de la corriente superior a alrededor de 200 pA, y una amplitud de la corriente que no varía en más de aproximadamente un 20% a lo largo de una hora bajo condiciones control.

Los términos "progenie" y "descendientes" tal y como se utilizan aquí se refieren a las células obtenidas mediante cultivo o de cualquier otro modo de obtener una célula de la invención. El término "derivado" tal y como se utiliza aquí se refiere a una célula que se obtiene mediante modificación, fusión, transfección, transformación o de cualquier otro modo de cambiar una célula de la invención. Por ejemplo, pueden crearse derivados trasfectando una célula de la invención con un plásmido o virus, fusionándola con una célula de hibridoma y similares.

El término "medidas electrofisiológicas" o "experimento de control en parche" se refiere a un procedimiento experimental en el que el potencial de voltaje de parte o la totalidad de una membrana celular (típicamente en una célula aislada) se mantiene a un voltaje predeterminado, luego se somete a uno o más cambios en el voltaje, durante y/o tras los cuales se mide la corriente que pasa a través de la membrana. En el experimento de medida de hERG utilizado aquí, se fija inicialmente el voltaje de una célula que expresa hERG en su superficie a un potencial de mantenimiento de -80 mV, y se calculó la diferencia de escape entre un pulso de 100 ms hasta -40 mV, seguido de 1000 ms a 20 mV (pre-pulso), y 500 ms a -40 mV (pulso de prueba). La corriente de hERG se midió como el pico (al inicio del pulso de prueba) a -40 mV tras la corrección con la corriente de escape. Pueden utilizarse variaciones de este protocolo. La inhibición de la corriente de hERG debida a la interacción de un fármaco con el canal de potasio hERG se mide durante el pulso de prueba y se indica como "corriente de prueba". En las líneas celulares de la invención, la corriente de prueba varía en menos de aproximadamente el 20% en una situación control, que dura hasta una hora. El término "instrumento de control en parche" se refiere a cualquier instrumento o dispositivo adecuado para realizar tales medidas, como por ejemplo, un control en parche estándar como IonWorks HT, IonWorks Quattro, PatchXpress 7000A y similares.

"Sujeto" incluye mamífero y aves. "Mamíferos" significa cualquier miembro de la clase mammalia, lo que incluye pero no se limita a los humanos, primates no humanos como los chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja como vacas, caballos, ovejas, cabras y cerdos, animales domésticos como conejos, perros y gatos, animales de laboratorio, lo que incluye roedores, como las ratas, ratones y conejillos de indias, y similares. El término "sujeto" no indica una edad o sexo particular.

"Tratar" o "tratamiento" de una enfermedad incluye (i) prevenir la enfermedad, es decir conseguir que los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen en un sujeto que puede estar expuesto o predispuesto a la enfermedad, pero que aun no experimenta o muestra síntomas de la enfermedad; (ii) inhibir la enfermedad, es decir, detener el desarrollo...

1. Una línea celular eucariota estable que consiste esencialmente en CHO crelox-hERG UG#7, ATCC PTA-6812, o su progenie, derivados o descendientes.

2. Un método para determinar la capacidad de un compuesto de prueba de inhibir hERG, u dicho método comprende:

a) proporcionar una célula eucariota estable de la reivindicación 1;

b) poner en contacto dicha célula con un compuesto de prueba;

c) medir una corriente de prueba en un instrumento de control en parche (patch clamp); y

d) determinar si la corriente de prueba se reduce en presencia de dicho compuesto de prueba.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicha corriente de prueba en dicha célula se compara antes y después de poner en contacto dicha célula con dicho compuesto de prueba.

4. El método de la reivindicación 2, en el que dicha corriente de prueba en dicha célula se compara con una corriente de prueba en una célula sustancialmente idéntica en ausencia de dicho compuesto de prueba.

5. El método de la reivindicación 2, en el que dicha corriente de prueba en dicha célula se compara con una corriente de prueba en una célula sustancialmente idéntica que se pone en contacto con un compuesto del que se sabe que no posee efectos inhibitorios de hERG.

6. El método de la reivindicación 2, en el que dicha corriente de prueba en dicha célula se compara con una corriente de prueba en una célula sustancialmente idéntica que se pone en contacto con un compuesto del que se sabe que muestra un nivel inaceptable de inhibición de hERG.