LAWSONIA INTRACELLULARIS DE ORIGEN EUROPEO Y VACUNAS, AGENTES DE DIAGNOSTICO Y METODOS DE USO DE LA MISMA.

Una cepa clínica virulenta de Lawsonia intracellularis, en la que dicha cepa clínica virulenta es la cepa clínica de Lawsonia intracellularis depositada en la ATCC con el nº PTA-4927 o cualquier cepa clínica avirulenta de Lawsonia intracellularis de origen europeo,

caracterizada porque dicha Lawsonia intracellularis avirulenta no provoca la presencia en heces el día 14 después de la vacunación

Lawsonia intracellularis de origen europeo y vacuna, agentes de diagnóstico y métodos de uso de la misma.

Antecedentes

La presente invención trata de vacunas de Lawsonia intracellularis y describe métodos para proteger frente a, y diagnosticar, una infección por L. intracellularis. Los productos y procesos de la invención son posibles, en parte, como resultado de un método mejorado para cultivar provisiones a gran escala de L. intracellularis, incluyendo tanto una nueva cepa clínica de L. intracellularis de origen europeo como un método para preparar un producto liofilizado que contiene la cepa clínica europea atenuada como un producto de vacuna.

L. intracellularis, el agente causal de la enteropatía proliferativa porcina ("PPE"), afecta prácticamente a todos los animales, incluyendo: conejos, hurones, hámsters, zorros, caballos y otros animales tan distintos como avestruces y emus. L. intracellularis es una causa particularmente grande de pérdidas en el ganado porcino de Europa, así como de los Estados Unidos.

Una característica uniforme de la PPE es la aparición de bacilos curvados intracitoplasmáticos no unidos a la membrana dentro de los enterocitos de las porciones afectadas del intestino. La bacteria asociada con la PPE se ha denominado "organismos de tipo Campylobacter". S. McOrist y col., Vet. Pathol., Vol. 26, 260-264 (1989). Posteriormente, se ha identificado la bacteria causal como un nuevo género y especie taxonómicos, comúnmente denominada Ileal symbiont (IS) intracellularis. C. Gebhart y col., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, nº 3, 533-538 (1993). Más recientemente, estas nuevas bacterias han recibido el nombre taxonómico de Lawsonia (L.) intracellularis. S. McOrist y col., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, nº 4, 820-825 (1995). Estos tres nombres se han usado de forma intercambiable para referirse al mismo organismo, según se identificará y describirá adicionalmente en este documento.

L. intracellularis es una bacteria intracelular obligada que no puede cultivarse mediante los métodos bacteriológicos normales en un medio acelular convencional, y se ha creído que requiere de células epiteliales adheridas para su crecimiento. S. McOrist y col., Infection and Immunity, Vol. 61, nº 19, 4286-4292 (1993) y G. Lawson y col., J. of Clinical Microbiology, Vol. 31, nº 5, 1136-1142 (1993) discuten sobre el cultivo de L. intracellularis usando monocapas de células IEC-18 epiteliales intestinales de rata en matraces de cultivo tisular convencionales. Además, H. Stills, Infection and Immunity, Vol. 59, nº 9, 3227-3236 (1991) discuten el uso de monocapas de células Intestine 407 intestinales embrionarias humanas y monocapas de células colónicas de adenocarcinoma GPC-16 de cobaya en matraces de cultivo tisular convencionales.

Recientemente se ha aprobado una vacuna de L. intracellularis para su uso en los Estados Unidos, vacuna que está basada en las cepas clínicas de L. intracellularis descritas y reivindicadas en las patentes de Estados Unidos n^os 5.714.375 y 5.885.823. La vacuna descrita anteriormente es comercializada por Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., 2621 North Belt Highway, St. Joseph, Missouri 64506-2002, con el nombre comercial ENTERISOL® Ileitis e incluye bacterias L. intracellularis vivas atenuadas de origen norteamericano.

Sumario de la invención

Un objeto de la invención es proporcionar una vacuna mejorada de L. intracellularis usando una cepa clínica de origen europeo.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método de cultivo mejorado de L. intracellularis a gran escala y técnicas mejoradas para la producción de vacunas de L. intracellularis.

Para conseguir estos y otros objetos, y según el propósito de la invención, según se ejemplifica y se describe ampliamente en este documento, la presente invención proporciona una nueva cepa clínica de L. intracellularis de Europa, un método para atenuar dicha cepa clínica y la cepa clínica atenuada del mismo. En este documento también se proporciona una vacuna que comprende la cepa clínica atenuada. En este documento también se proporciona un método para producir una vacuna que comprende la cepa clínica atenuada en forma liofilizada para su reconstitución en el momento de su administración y el producto liofilizado de la misma.

En una forma de realización, la nueva cepa clínica L. intracellularis de Europa, la cepa clínica DK 15540, es la cepa clínica depositada en la ATCC con el nº de acceso PTA-4927. En otra forma de realización, la cepa clínica atenuada derivada de la cepa clínica DK 15540, se denomina cepa clínica B3903, con el nº de acceso de la ATCC PTA-4926.

Descripción detallada

Según se usa en este documento, el término "L. intracellularis" significa la bacteria intracelular curvada gram-negativa descrita detalladamente por C. Gebhart y col., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, nº 3, 533-538 (1993) y S. McOrist y col., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, nº 4, 820-825 (1995), cada uno de las cuales se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad, e incluye, pero no se limita a, la cepa clínica denominada DK 15540 que se depositó bajo el Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 el 9 de enero de 2003 y se le asignó el número de acceso de la ATCC PTA-4927; bacteria causal que puede obtenerse a partir de cerdos o de otros animales infectados por PPE por todo el mundo dados los conocimientos en la materia y las enseñanzas de este documento; y variantes o mutantes de cualquiera de las anteriores bacterias, obtenidas tanto espontánea como artificialmente.

Según se usa en este documento, la expresión "cepa clínica atenuada" significa cualquier cepa clínica de L. intracellularis que se prepara según las técnicas de cultivo y de pase enseñadas en este documento para conseguir la avirulencia manteniendo a la vez las propiedades inmunógenas cuando se administra a un animal hospedador, incluyendo, pero no limitándose a, la cepa clínica atenuada denominada B-3903 que se depositó bajo el Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 el 9 de enero de 2003 y se le asignó el número de acceso PTA-4926.

La cepa clínica atenuada de la invención puede usarse como inmunógeno en vacunas antimicrobianas para animales, incluyendo aves, peces y mamíferos tales como vacas, cerdos, caballos y primates. Dichas vacunas pueden prepararse mediante las técnicas conocidas por los expertos en la materia y dadas las enseñanzas contenidas en este documento. Dicha vacuna comprendería una cantidad inmunológicamente eficaz de la cepa clínica atenuada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La vacuna podría ser administrada en una o más dosis. Una cantidad inmunológicamente eficaz se determina mediante los medios conocidos en la materia sin una experimentación ilícita, dadas las enseñanzas contenidas en este documento. La cantidad de bacterias avirulentas debería ser suficiente para estimular una respuesta inmune en animales susceptibles a la enfermedad siendo todavía avirulentas. Esto dependerá del animal en particular, de las bacterias y de la enfermedad implicada. La dosis recomendada a administrar al animal susceptible es preferiblemente de aproximadamente una TCID₅₀ (dosis infectiva del cultivo tisular al 50% del punto final)/dosis de 3,0 hasta aproximadamente una TCID₅₀/dosis de 6,0, y más preferiblemente de aproximadamente una TCID₅₀/dosis de 4,0 hasta aproximadamente una TCID₅₀/dosis de 5,0. En una forma de realización preferible, el título de la vacuna es de aproximadamente una TCID₅₀/dosis de 4,9, según se determina mediante el ensayo de Dosis Infectiva Del Cultivo Tisular al 50% de dilución del punto final (TCID₅₀). Los vehículos son conocidos por los expertos en la materia, e incluyen estabilizantes y diluyentes. Dicha vacuna también puede contener un coadyuvante apropiado. Las vacunas de la invención pueden usarse en combinación con otras vacunas, por ejemplo, como diluyente de otra vacuna. Las preparaciones de la vacuna también pueden desecarse, por ejemplo, mediante liofilización, con el propósito de su almacenamiento o para su subsiguiente formulación en vacunas líquidas.

Consecuentemente, la...

1. Una cepa clínica virulenta de Lawsonia intracellularis, en la que dicha cepa clínica virulenta es la cepa clínica de Lawsonia intracellularis depositada en la ATCC con el nº PTA-4927 o cualquier cepa clínica avirulenta de Lawsonia intracellularis de origen europeo, caracterizada porque dicha Lawsonia intracellularis avirulenta no provoca la presencia en heces el día 14 después de la vacunación.

2. Una vacuna para la inmunización de un animal, que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de una Lawsonia intracellularis avirulenta según la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. La vacuna según la reivindicación 2, en la que la cantidad farmacéuticamente eficaz de la cepa clínica avirulenta de Lawsonia intracellularis es de una TCID₅₀ de 10³ hasta una TCID₅₀ de 10⁶ por dosis.

4. Una vacuna para la inmunización de un animal, que comprende la cepa clínica avirulenta de Lawsonia intracellularis según la reivindicación 1 y material antigénico procedente de al menos uno de los siguientes patógenos: especies del género Salmonella, especies del género Erysipelothrix, especies del género Haemophilus, especies del género Mycoplasma, especies del género Leptospira, especies del género Clostridium, especies del género Streptococcus, especies del género Brachyspira, circovirus, virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (PRRS), virus de la gripe porcina (SIV), virus transmisible de gastroenteritis (TGE), parvovirus y Escherichia coli; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. Una vacuna para la inmunización de un animal, que comprende la cepa clínica avirulenta de Lawsonia intracellularis según la reivindicación 1 y material antigénico procedente de Salmonella choleraesuis, especies del género Erysipelothrix, virus transmisible de gastroenteritis (TGE), Escherichia coli, especies del género Clostridium y especies del género Brachyspira; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Una vacuna para la inmunización de un animal, que comprende la cepa clínica avirulenta de Lawsonia intracellularis según la reivindicación 1 y material antigénico procedente de Salmonella choleraesuis y especies del género Erysipelothrix; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. Una vacuna para la inmunización de un animal, que comprende la cepa clínica avirulenta de Lawsonia intracellularis según la reivindicación 1 y material antigénico procedente de al menos uno de los siguientes patógenos: especies del género Clostridium, virus de la gripe equina (EIV), virus del herpes equino (EHV), alfavirus y virus del Nilo occidental; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. La cepa clínica avirulenta de Lawsonia intracellularis patógena según la reivindicación 1, para uso como una vacuna.

9. La cepa clínica avirulenta de Lawsonia intracellularis patógena según la reivindicación 8, para uso como una vacuna para proteger a un animal frente a la enteropatía proliferativa porcina.

10. Un método para elaborar una vacuna para inducir una respuesta inmune ante bacterias de Lawsonia intracellularis en un animal, que comprende las etapas de: (a) incubar una cepa clínica de Lawsonia intracellularis según la reivindicación 1 en células de cultivo que están en suspensión con una concentración de oxígeno de menos de aproximadamente el 10 por ciento para cultivar dichas bacterias; y (b) mezclar dichas bacterias cultivadas con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Un método para cultivar Lawsonia intracellularis según la reivindicación 1, que comprende:

(a)        infectar células cultivadas con un inóculo que comprende la cepa clínica avirulenta de Lawsonia intracellularis según la reivindicación 1,

(b)        incubar dichas células infectadas con una concentración de oxígeno de menos del 10 por ciento mientras se mantienen dichas células infectadas en suspensión mediante la agitación de dichas células, y

(c)        recolectar al menos una porción de dicha Lawsonia intracellularis.

12. El método según la reivindicación 11, en el que la concentración de oxígeno está en el intervalo del 0 por ciento al 8 por ciento.

13. El método según la reivindicación 12, en el que la concentración de oxígeno está en el intervalo del 0 por ciento al 3 por ciento.

14. El método según la reivindicación 11, en el que dicha incubación se produce con una concentración de dióxido de carbono en el intervalo de 6 por ciento al 10 por ciento.

15. El método según la reivindicación 11, en el que dichas células cultivadas se eligen del grupo formado por: células HEp-2, McCoy e IEC-18.

16. El método según la reivindicación 11, en el que dichas células IEC-18 se cultivan en microvehículos.

17. El método según la reivindicación 11, en el que las células infectadas se incuban según la etapa (c) durante un periodo de 2 hasta 10 días.

18. El método según la reivindicación 11, que comprende, además, una etapa (d) de liofilizar dichas bacterias recolectadas.

19. El método según la reivindicación 18, en el que dicha liofilización comprende una etapa primaria de secado y una etapa secundaria de secado.

20. Un método para el diagnóstico de la enteropatía proliferativa porcina, que comprende realizar un ensayo para detectar anticuerpos contra Lawsonia intracelluris en un sujeto animal no humano, que comprende:

(a)        poner en contacto una muestra del sujeto con la cepa clínica de Lawsonia intracellularis según la reivindicación 1 para formar un complejo antígeno-anticuerpo; y

(b)        detectar la formación de dicho complejo,

en el que la presencia de dicho complejo se correlaciona positivamente con un diagnóstico de la enteropatía proliferativa porcina.

21. El método según la reivindicación 20, en el que el ensayo comprende un ensayo elegido del grupo formado por: radioinmunoensayo, ensayo de inmunosorción enzimática (ELISA), inmunoensayo de fluorescencia y ensayo de inmunoelectroforesis.

22. Un método para producir antisueros contra Lawsonia intracelluris en un animal no humano, que comprende:

(a)        administrar la cepa clínica de Lawsonia intracelluris de la reivindicación 1 a un animal no humano en una cantidad eficaz para desencadenar una respuesta inmune; y

(b)        recoger el antisuero o el plasma que contiene los anticuerpos contra dicha Lawsonia intracelluris.