CULTIVO DE LAWSONIA INTRACELLULARIS, VACUNAS ANTI-LAWSONIA INTRACELLULARIS Y AGENTES DE DIAGNOSTICO.

Una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria en bacterias L.

intracellularis en un animal que comprende una cepa atenuada de L. intracellularis en un soporte farmacéuticamente aceptable, en donde dicha cepa atenuada está en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria, y en donde la vacuna comprende 50-500 microgramos de inmunógeno, y se utilizan bacterias purificadas, y en donde la cepa atenuada de L. intracellularis se puede obtener por un método que comprende obtener células de cultivo, infectadas con bacterias L. intracellularis, incubar dichas células infectadas a una concentración de oxígeno de aproximadamente 0 hasta aproximadamente 18 por ciento, agitar dichas células infectadas con el fin de cultivar dichas bacterias, al tiempo que se mantiene a dichas células infectadas en suspensión, hacer pasar al menos una parte de dichas bacterias cultivadas, recolectar al menos una parte de dichas bacterias cultivadas y seleccionar una cepa atenuada para proporcionar bacterias L. Intracellularis atenuadas

Cultivo de Lawsonia intracellularis, vacunas anti-Lawsonia intracellularis y agentes de diagnóstico.

Campo de la invención

La presente invención está dirigida a vacunas anti-Lawsonia intracellularis, y a métodos para proteger contra la infección por Lawsonia intracellularis, y para diagnosticarla. Los productos y procesos de la invención se pueden conseguir, en parte, como resultado del método mejorado que los autores de la invención han descubierto para cultivar grandes cantidades de L. intracellularis.

Descripción de la técnica relacionada

L. intracellularis, el agente causante de la enteropatía proliferativa porcina (siglas inglesas: PPE), afecta virtualmente a todos los animales, entre ellos a los seres humanos, conejos, hurones, hámsters, zorros, caballos, y otros animales tan distintos como avestruces y emús.

L. intracellularis causa pérdidas particularmente grandes en piaras de cerdos. Se ha estimado que la prevalencia e incidencia de la PPE en los Estados Unidos alcanzan hasta el 20% de la cabaña porcina, con unas pérdidas estimadas de 20 millones de dólares al año.

Una característica recurrente de la PPE es la presencia de bacilos intracitoplasmáticos curvados, no ligados a membrana, dentro de enterocitos en las porciones del intestino afectadas. Las bacterias asociadas con la PPE han sido denominadas "organismos similares a Campylobacter" (S. McOrist y otros., Vet. Pathol., volumen 26, 260-64 (1989)). Se ha identificado posteriormente a las bacterias causantes como género y especie taxonómicos nuevos, denominados en nuestro idioma simbionte ileal (siglas inglesas: IS) intracelular (C. Gebhart y otros, Int'l. J. of Systemic Bacteriology, volumen 43, número 3, 533-38 (1993)). Más recientemente, se ha dado a estas nuevas bacterias el nombre taxonómico Lawsonia (L.) intracellularis S. McOrist y otros, Int'l. J. of Systemic Bacteriology, volumen 45, número 4, 820-25 (1995)). Se han empleado estos tres nombres, de manera indistinta, para designar al mismo organismo, que es identificado y descrito con mayor detalle en la presente memoria. Los autores de la invención se han propuesto emplear el nombre taxonómico, L. intracellularis, a lo largo de la discusión de la presente invención.

L. intracellularis es una bacteria intracelular obligada que no puede ser cultivada por métodos bacteriológicos normales en medios convencionales, exentos de células, y se ha pensado que para crecer precisa células epiteliales unidas. S. McOrist y otros, Infection and Immunity, volumen 61, número 10, 4286-92 (1993) y G. Lawson y otros, J. of Clinical Microbiology, volumen 31, número 5, 1136-42 (1993) discuten el cultivo de L. intracellularis empleando monocapas de células IEC-18 del epitelio intestinal de rata en frascos convencionales para cultivo de tejidos. Además, H. Stills, en Infection and Immunity, volumen 59, número 9, 3227-36 (1991) discute el empleo de monocapas de células intestinales embriónicas humanas Intestine 407 y de monocapas de células GPC-16 de adenocarcinoma de colon de cobaya en frascos convencionales para cultivo de tejidos. Estos métodos de cultivo existentes son muy laboriosos e inadecuados para ser escalados.

Los fastidiosos requisitos de crecimiento de L. intracellularis en cultivos in vitro han dificultado en gran medida la comprensión actual de la infección por L. intracellularis y el tratamiento y control eficaces de la enfermedad. Existe actualmente la necesidad de un método mejorado para cultivar L. intracellularis. Existe también la necesidad de vacunas contra L. intracellularis, y de herramientas eficaces para diagnosticar la infección por L. intracellularis.

Sumario de la invención

Es un objeto de la invención proporcionar vacunas anti-L. intracellularis.

Otro objeto de la invención es proporcionar métodos para detectar la presencia de anticuerpos contra L. Intracellularis en muestras biológicas.

Es un objeto adicional proporcionar un método de cultivo mejorado que permita el cultivo a gran escala de L. intracellularis, para producir vacunas y agentes de diagnóstico.

Para conseguir estos y otros objetos, y de acuerdo con el propósito de la invención, tal como se realiza y se describe a grandes rasgos en la presente memoria, la presente invención proporciona un método para cultivar L. intracellularis, y suministrar a gran escala bacterias producidas mediante dicho método.

Según dicho método, se incuban bacterias de L. intracellularis bajo una concentración de oxígeno de aproximadamente 0 por ciento a aproximadamente 18 por ciento, mientras se agitan las bacterias para cultivar L. intracellularis, manteniendo las bacterias en suspensión.

Según otra realización, se proporciona un método para cultivar bacterias de L. intracellularis inoculando una monocapa de células HEp-2, McCoys o IEC-18, que presente aproximadamente 30 por ciento de confluencia, con un inóculo que comprenda bacterias de L. intracellularis, a fin de infestar las células con las bacterias. Después se incuban las células infectadas, a una temperatura de aproximadamente 36 hasta aproximadamente 38ºC, bajo una concentración de oxígeno de aproximadamente 0 por ciento hasta aproximadamente 8,0 por ciento, hasta que las células alcanzan la confluencia. A continuación se disponen las células infectadas y medio de cultivo en un fermentador, biorreactor, matraz agitado u otro recipiente adecuado para mantener las células en suspensión. Se incuban las células infectadas mientras son agitadas, a fin de cultivar las bacterias de L. intracellularis mientras se mantienen en suspensión las células infectadas. A continuación se traspasa una porción de L. intracellularis cultivada a nuevas células de cultivo, para incrementar la producción de bacterias de L. intracellularis.

La invención proporciona vacunas anti-L. intracellularis y métodos para producir vacunas contra L. intracellularis. Se produce una bacteria L. intracellularis avirulenta traspasando un número de veces suficiente las bacterias L. intracellularis cultivadas, y seleccionando una cepa atenuada, o bien sometiendo a las bacterias cultivadas a medios químicos de atenuación. Empleando los métodos de cultivo de la invención también se preparan vacunas con L. intracellularis muertas. De acuerdo con una realización particularmente preferida, se cultivan de manera continua las bacterias durante al menos aproximadamente 6 a 8 meses, durante los cuales son traspasadas al menos aproximadamente 7 a 12 veces, a fin de producir una cepa atenuada destinada al empleo como vacuna. A continuación se mezclan las bacterias atenuadas con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y se administran a un animal en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria. Los autores de la invención han depositado la cepa atenuada actualmente preferida (N343NP40wk) en la colección estadounidense de cultivos tipo American Type Culture Collection.

La invención también proporciona un método para determinar la presencia de anticuerpos que específicamente reaccionan con bacterias L. Intracellularis en una muestra biológica, recolectando al menos una parte de las bacterias L. Intracellularis cultivadas, poniendo en contacto una muestra biológica de un animal con bacterias L. Intracellularis recolectadas o un componente de las mismas en condiciones en las que el anticuerpo presente en la muestra biológica reacciona con la L. Intracellularis o el componente, y determinar si ha ocurrido una reacción anticuerpo- antígeno.

En la descripción que sigue se expondrán características y ventajas adicionales de la invención, que serán evidentes de dicha descripción, o bien de la práctica de la invención.

Descripción de las realizaciones preferidas

Tal como se emplea en esta memoria, la expresión "L. intracellularis" significa las bacterias intracelulares, curvadas, gram-negativas, descritas con detalle por C. Gebhart y otros, Int'l. J. of Systemic Bacteriology, volumen 43, número 3, 533-38 (1993) y S. McOrist y otros, Int'l. J. of Systemic Bacteriology, volumen 45, número 4, 820-25 (1995) (cada uno de los cuales se incorpora en esta memoria como referencia en su totalidad), e incluye, aunque sin estar limitada a las mismas, las bacterias depositada como ATCC 55672 en la American Type Culture Collección, Rockville, MD; las bacterias depositadas...

1. Una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria en bacterias L. intracellularis en un animal que comprende una cepa atenuada de L. intracellularis en un soporte farmacéuticamente aceptable, en donde dicha cepa atenuada está en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria, y en donde la vacuna comprende 50-500 microgramos de inmunógeno, y se utilizan bacterias purificadas, y en donde la cepa atenuada de L. intracellularis se puede obtener por un método que comprende obtener células de cultivo, infectadas con bacterias L. intracellularis, incubar dichas células infectadas a una concentración de oxígeno de aproximadamente 0 hasta aproximadamente 18 por ciento, agitar dichas células infectadas con el fin de cultivar dichas bacterias, al tiempo que se mantiene a dichas células infectadas en suspensión, hacer pasar al menos una parte de dichas bacterias cultivadas, recolectar al menos una parte de dichas bacterias cultivadas y seleccionar una cepa atenuada para proporcionar bacterias L. Intracellularis atenuadas.

2. La vacuna según la reivindicación 1, en donde la vacuna comprende entre 10⁷ y 10⁹ TCID₅₀ de inmunógeno.

3. La vacuna según la reivindicación 1, en donde el soporte se selecciona del grupo que consiste en solución, emulsión o suspensión acuosa.

4. Una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria en bacterias L. intracellularis en un animal, que comprende bacterias L. intracellularis muertas en un soporte farmacéuticamente aceptable, en donde dichas bacterias se producen de acuerdo con el método de cultivar bacterias L. intracellularis, que comprende las etapas de incubar dichas bacterias a una concentración de oxígeno de menos de aproximadamente 18 por ciento, y mantener dichas bacterias en suspensión para cultivar dichas bacterias, en donde dichas bacterias están en células de cultivo que se mantienen en suspensión y están en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria, y en donde la vacuna comprende 50 - 500 microgramos de inmunógeno, y se utilizan bacterias purificadas.

5. La vacuna según la reivindicación 4, en donde la vacuna comprende entre 10⁷ y 10⁹ TCID₅₀ de inmunógeno.

6. La vacuna según la reivindicación 4 ó 5, en donde las bacterias se exterminan mediante exposición prolongada a niveles de O₂ ambiente o formalina al 0,3%.

7. La vacuna según la reivindicación 6, en donde la vacuna comprende, además, un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de aluminio o aceite mineral.

8. La vacuna según la reivindicación 1 ó 4, en donde L. intracellularis que infecta las células de cultivo se prepara a partir de un homogeneizado intestinal de un animal infectado con L. intracellularis.

9. La vacuna según la reivindicación 1, en donde dicha cepa atenuada es la cepa N343NP40wk depositada como ATCC 55783.

10. La vacuna según las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha vacuna se utiliza en combinación con otras vacunas.

11. Uso de una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la fabricación de un medicamento para proteger animales frente a infecciones por L. Intracellularis.

12. Una vacuna, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una cepa atenuada de bacterias L. intracellularis en un soporte farmacéuticamente aceptable, en donde la cepa atenuada de L. intracellularis se puede obtener por un método que comprende obtener células de cultivo, infectadas con bacterias L. intracellularis, incubar dichas células infectadas a una concentración de oxígeno de aproximadamente 0 hasta aproximadamente 18 por ciento, agitar dichas células infectadas con el fin de cultivar dichas bacterias, al tiempo que se mantiene a dichas células infectadas en suspensión, hacer pasar al menos una parte de dichas bacterias cultivadas, recolectar al menos una parte de dichas bacterias cultivadas y seleccionar una cepa atenuada para proporcionar bacterias L. Intracellularis atenuadas.

13. La vacuna según la reivindicación 12, en donde una dosis de dicha vacuna comprende 10³ hasta 10⁹ bacterias por kg de peso corporal del animal.

14. La vacuna según la reivindicación 12 ó 13, en donde dicha vacuna se utiliza en combinación con otras vacunas.