Proteína recombinante, en la que dicha proteína recombinante se forma por la fusión de la subunidad A2 y la subunidad B de la enterotoxina termolábil de Escherichia coli enterotoxigénica y la subunidad B de la ureasa de Helicobacter pylori

CAMPO TÉCNICO

La invención se refiere al campo de los compuestos biofarmacéuticos, se refiere especialmente a una proteína recombinante usada para la inmunoprofilaxis de la infección humana por Helicobacter pylori y a una preparación de vacuna oral de liberación lenta encapsulada en microesferas degradables preparada a partir de la proteína recombinante, y al método de preparación de la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En 2005 se otorgó el Premio Nobel en medicina/fisiología a dos científicos que descubrieron Helicobacter pylori (Hp). Se cree que Helicobacter pylori es una bacteria patógena importante para las enfermedades del tracto digestivo superior en el ser humano y la principal causa patógena de gastritis crónica, úlcera gástrica y úlcera duodenal. La Organización Mundial de la Salud (OMS) en su estudio sobre Helicobacter pylori también ha confirmado que Hp es una bacteria patógena estrechamente relacionada con el cáncer gástrico, clasificándola como el factor carcinogénico principal. Hp es una de las bacterias con la tasa de infección más alta en el mundo, alcanzando una tasa de infección del 50% en la población global e incluso mayor en países en vías de desarrollo. En China, existen nada menos que seiscientos millones de personas infectadas por Hp, y cada año mueren doscientas mil personas de cáncer gástrico. Por tanto, Hp constituye una gran amenaza para la salud humana. A pesar de la importancia clínica positiva, la terapia con antibióticos actual de la infección por Hp todavía tiene algunas desventajas obvias: 1) efectos secundarios tóxicos y adversos; 2) generación de cepas resistentes a fármacos; 3) alto coste; 4) ciclo de tratamiento prolongado y escaso cumplimento del paciente; y 5) efecto terapéutico inestable. Por otra parte, la vacuna se considera el medio más rentable para controlar enfermedades infecciosas. Mediante la inducción de una respuesta inmunitaria específica en el organismo, puede usarse la vacunación para prevenir o tratar una infección por Hp. Aunque el progreso en la investigación en vacunas de células completas está limitado por la dificultad en el cultivo a gran escala de Hp y la existencia de un potencial carcinógeno en el antígeno bruto, el desarrollo de vacunas obtenidas mediante ingeniería genética se ha convertido en la principal dirección debido a su seguridad, eficacia, bajo coste, y facilidad en su generación y uso. Aunque se han investigado exhaustivamente tanto de manera interna como en el exterior, las vacunas de Hp todavía no son satisfactorias.

La ureasa, una enzima dependiente de níquel, cataliza la hidrólisis de la urea en amoniaco y ácido carbónico, y es la proteína más abundante expresada en Helicobacter pylori tanto dentro de las células como en la membrana celular, representando el 5%-10% de la proteína de Hp total. La ureasa descompone la urea para producir amoniaco, lo que ayuda a las bacterias a colonizar el estómago neutralizando el ácido gástrico así como suministrando amoniaco para la síntesis proteica bacteriana. Por tanto, los tejidos del huésped de Hp pueden sufrir lesiones directamente por el amoniaco o indirectamente por la estimulación de la reacción inflamatoria inducida por la ureasa. El bloqueo de la expresión génica de la ureasa puede inhibir la colonización de Helicobacter pylori en el huésped, reducir la síntesis proteica bacteriana, y disminuir la reacción inflamatoria relacionada con Helicobacter pylori. El anticuerpo frente a la ureasa B puede detectarse en todos los pacientes infectados por Hp, especialmente en aquéllos con síntomas marcados, y el nivel de anticuerpos es, hasta cierto punto, importante para la gravedad de los estados de la enfermedad. La inyección oral de la ureasa de Helicobacter pylori o la subunidad B de la ureasa recombinante (UreBr) puede proteger a los ratones frente a la infección por Helicobacter pylori y eliminar la infección preexistente (Michetti et al., Gastroenterol.1994). La actividad de la ureasa parece desempeñar un papel importante en la infección por Hp, ya que Hp con pérdida de la actividad de la ureasa no da como resultado la infección en el modelo animal. Por tanto, un anticuerpo que neutraliza la actividad de la ureasa puede desempeñar un papel crucial en la resistencia contra la colonización por Hp. Los hallazgos anteriores indican que los anticuerpos de la ureasa, especialmente el que puede neutralizar la actividad de la ureasa, podrían ejercer el papel principal en la resistencia contra la infección por Hp.

El sistema inmunitario de la mucosa es una parte importante del sistema inmunitario del organismo, incluyendo principalmente tejido linfático asociado a la mucosa intestinal y tejido linfático asociado a bronquios, etc., y ejerce una acción única con respecto a la función de defensa del organismo. Los ganglios linfáticos mesentéricos y la gran cantidad de linfocitos dispersados en la lámina propia de la mucosa y los epitelios intestinales constituyen los sitios de inducción inmunitaria y los sitios de efecto inmunitario. A través de la captación, el procesamiento y la extracción de antígenos, diversos inmunocitos en la superficie de la mucosa gastrointestinal, etc. producen y secretan anticuerpos específicos frente a antígenos (principalmente sIgA) que se unen específicamente con vectores bacterianos o virales que portan antígenos para impedirles que colonicen la superficie de la mucosa o invadan el organismo, ejerciendo así una determinada función de defensa inmunológica.

Sin embargo; el defecto más grave del sistema inmunitario de la mucosa es que es probable que desarrolle tolerancia inmunológica a los antígenos. Incluso con un nivel de antígeno aumentado, el nivel de sIgA específico frente a antígenos producido por el organismo o la mucosa sigue siendo bastante bajo, y la capacidad de defensa inmunitaria frente a la infección de los microorganismos que portan antígenos es pésima.

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La toxina termolábil (LT) es una enterotoxina termolábil producida por Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) y puede inducir diarrea grave en el ser humano y en algunos animales domésticos. La LT está compuesta por una subunidad A (LTA) y cinco subunidades B (LTB). De manera espacial, cinco LTB completamente idénticas forman un pentámero circular, cuyo centro se encuentra en la LTA con su extremo C-terminal unido a la LTB mediante enlaces no covalentes. La subunidad A está compuesta por dos subunidades A1 y A2, unidas mediante un puente disulfuro, en la que A1 es la parte tóxica de la toxina mientras que A2 se une con la subunidad B. Las subunidades A y B en el citoplasma existen en la forma de precursor que porta péptidos señal, y sólo se ensamblan para dar LT intacta tras pasar a través de la membrana celular. La subunidad B sirve para unirse específicamente con el receptor de gangliósido GM1 en la superficie de la célula eucariota para realizar la transición conformacional de la molécula de LT; la subunidad A se disocia de la subunidad B y entra en la membrana celular, seguido por la degradación del puente disulfuro y la activación de la cadena peptídica de A1; y la subunidad A1 tiene la actividad de una ADPribosilación transferasa independiente de GTP, que destruye la degradación y el equilibrio del AMPc intracelular a través de la reacción de ADP-ribosilación mediada por proteína G y desencadena el aumento del nivel de AMPc, induciendo así el efecto de la toxina.

En los últimos años, la LT se considera un prometedor adyuvante inmunitario de la mucosa. La investigación realizada por Rollwagen etc. mostró que la LT puede reforzar la respuesta inmunitaria de la mucosa frente a campilobacterias y acelerar la eliminación de las bacterias en el tracto intestinal; y además, los animales inmunizados inicialmente con LT y un antígeno no desarrollan tolerancia inmunológica al antígeno incluso tras una observación a largo plazo.

Generalmente se ha aceptado el punto de vista de que la LT puede usarse como adyuvante inmunitario de la mucosa (Lycke N, et al. Immunology, 1986, 59(2):301-308; Clements JD, et al. Vaccine, 1988, 6(3):269-277; Giuliani MM, et al. J. Exp. Med., 1998, 187(7):1123-1132). Puesto que la LT tiene una toxicidad intestinal muy fuerte, se usó en consecuencia principalmente como adyuvante su subunidad B o mutante de LT de baja toxicidad o no tóxico construido (Yamamoto M, et al. J. Immunol., 1999, 162:7015-7021; Martin M, et al. J.Immunol., 2002, 169(4):17441752; Tamura SI, et al. Vaccine, 1994, 12:1238-1240). Sin embargo, la subunidad A de la LT, además de su actividad de la enzima ADP-ribosil,... [Seguir leyendo]

1. Proteína recombinante, en la que dicha proteína recombinante se forma por la fusión de la subunidad A2 y la subunidad B de la enterotoxina termolábil de Escherichia coli enterotoxigénica y la subunidad B de la ureasa de Helicobacter pylori.

2. Preparación oral encapsulada en microesferas de liberación lenta, en la que dicha preparación encapsula la proteína recombinante de la reivindicación 1.

3. Preparación oral encapsulada en microesferas de la reivindicación 2, en la que dichas sustancias de encapsulación incluyen alginato de sodio, aceite vegetal, cloruro de calcio y quitosano.

4. Preparación oral encapsulada en microesferas de la reivindicación 2 ó 3, en la que el diámetro de la partícula de dicha preparación encapsulada en microesferas es de 3,33 m.

5. Preparación oral encapsulada en microesferas de la reivindicación 2 ó 3, en la que dicha preparación encapsulada es una preparación liofilizada.

6. Preparación liofilizada de la reivindicación 5, en la que el excipiente de la preparación liofilizada es manitol al 8%, el agente estabilizante es EDTA-Na2 al 0,05%, y el valor de pH óptimo es de 10,0.

7. Secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína recombinante de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos es ItA2B-ureB formada por la fusión del gen codificante de la subunidad A2 y el gen codificante de la subunidad B de la enterotoxina termolábil de Escherichia coli enterotoxigénica, y el gen codificante de la subunidad B de la ureasa de Helicobacter pylori.

8. Plásmido recombinante, en el que dicho plásmido está formado mediante ligación de la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 7 y el plásmido pET-11c.

9. Método para preparar la proteína recombinante de la reivindicación 1, en el que dicho método comprende las siguientes etapas:

(1) clonar respectivamente las secuencias de nucleótidos codificantes de la subunidad B de la ureasa UreB de Helicobacter pylori y la subunidad de enterotoxina termolábil LTA2B de Escherichia coli enterotoxigénica,

o clonar las secuencias de nucleótidos codificantes de las secuencias de aminoácidos que tienen una homología superior al 95% con las mismas y que tienen también sus actividades de proteína;

(2) unir las secuencias de nucleótidos obtenidas mediante la clonación en la etapa (1) mediante el método de PCR solapante para formar el gen de fusión ItA2B-ureB;

(3) construir el gen de fusión ItA2B-ureB en un vector, transformar un huésped, y expresar la proteína recombinante LTA2B-UreB;

(4) separar y purificar la proteína recombinante obtenida de la etapa (3).

10. Método para preparar vacuna oral de Helicobacter pylori recombinante, que comprende las siguientes etapas:

(1) proporcionar a la proteína recombinante obtenida en la reivindicación 9 con alginato de sodio, aceite vegetal, cloruro de calcio, y quitosano, y preparar para dar una preparación encapsulada en microesferas de liberación lenta degradables; y

(2) preparar opcionalmente la preparación encapsulada en microesferas de liberación lenta para dar un producto liofilizado.