PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION A GRAN ESCALA DE INOCULO MICELIAR DE BASIDIOMICETOS.

Procedimiento para la obtención a gran escala de inóculo miceliar de basidiomicetos.



La presente invención proporciona un procedimiento para la obtención in vitro de micelio fúngico en cultivo puro, aislado, tanto de los cuerpos fructíferos de especies fúngicas de interés, como de secciones de raicillas de plantas micorrizadas con dichas especies fúngicas

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200930246.

Solicitante: UNIVERSIDAD POLITECNICA DE MADRID.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: MADRID.

Inventor/es: JIMENEZ AGUILAR,MARIA DE LA CON, PEREZ LECUONA,ERNESTO.

Fecha de Solicitud: 2 de Junio de 2009.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 17 de Mayo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01G1/04 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01G HORTICULTURA; CULTIVO DE LEGUMBRES, FLORES, ARROZ, FRUTOS, VID, LUPULO O ALGAS; SILVICULTURA; RIEGO (recolección de frutas, verduras, lúpulo o productos similares A01D 46/00; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; dispositivos para desmochar o pelar las cebollas o bulbos de flor A23N 15/08; crecimiento de algas unicelulares C12N 1/12; cultivo de células vegetales C12N 5/00). › A01G 1/00 Horticultura; Cultivo de legumbres (etiquetas o placas de identificación G09F 3/00, G09F 7/00). › Cultivo de setas (abonos compuestos o fertilizantes para el cultivo de setas C05).
  • C12N1/14 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Microorganismos fúngicos (cultivo de setas A01G 1/04; como novedades vegetales A01H 15/00 ); Sus medios de cultivo.

Clasificación PCT:

  • A01G1/04 A01G 1/00 […] › Cultivo de setas (abonos compuestos o fertilizantes para el cultivo de setas C05).
  • C12N1/14 C12N 1/00 […] › Microorganismos fúngicos (cultivo de setas A01G 1/04; como novedades vegetales A01H 15/00 ); Sus medios de cultivo.
PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION A GRAN ESCALA DE INOCULO MICELIAR DE BASIDIOMICETOS.

Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la obtención a gran escala de inóculo miceliar de basidiomicetos.

Campo de la invención

La presente invención se encuadra dentro del campo general de agrobiotecnología y en particular se refiere a la producción a gran escala de inóculo micelial de especies fúngicas.

Estado de la técnica

Hasta el presente, no hay referencias acerca de la producción a gran escala de inóculo micelial de las especies fúngicas Amanita caesarea y Boletus aereus. Existe pues un gran interés en encontrar un procedimiento sencillo, rápido y económico para la obtención de micelio en cultivo puro de dichas especies, para su utilización en la producción en vivero de plantas micorrizadas de especies forestales de interés comercial, con fines de restauración forestal y recuperación de la producción micológica en las zonas naturales, así como, para la producción controlada, en vivero-plantación, de hongos comestibles de gran importancia comercial.

Objeto de de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para la obtención in vitro de micelio fúngico en cultivo puro, aislado, tanto de los cuerpos fructíferos de especies fúngicas de interés, como de secciones de raicillas de plantas micorrizadas con dichas especies fúngicas.

Así pues, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de micelio fúngico en cultivo puro que comprende las siguientes etapas:

a) Aislamiento del micelio fúngico a partir de cuerpos fructíferos de hongos y/o secciones de raicillas de plantas micorrizadas,
b) Inoculación del micelio aislado en la etapa a) en un medio de cultivo sólido de avena modificado (MOM),
c) Purificación del micelio,
d) Desarrollo del micelio purificado en la etapa c) en un medio de cultivo líquido BAF modificado,
e) Obtención del inóculo miceliar

En un aspecto más particular de la presente invención, el aislamiento del micelio fúngico se realiza a partir de cuerpos fructíferos; en un aspecto más en particular, el hongo a partir del cual se obtiene el micelio es seleccionado de la Clase Basidiomicetos, en particular es seleccionado de entre los géneros Amanita y Boletus. En otro aspecto más en particular, el hongo a partir del cual se obtiene el micelio es Amanita caesarea. En otro aspecto particular, el otro hongo a partir del cual se obtiene el micelio es Boletus aereus.

En otro aspecto más en particular de la presente invención, el aislamiento del micelio fúngico se realiza a partir de secciones de raicillas de plantas micorrizadas, en un aspecto más en particular, el micelio es seleccionado de entre los géneros Quercus y Cistus.

En otro aspecto más en particular de la presente invención, el medio de cultivo sólido MOM de la etapa b) contiene como nutrientes calcio, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, cloro, azufre, sacarosa, levadura y agar. En un aspecto más en particular, el medio de cultivo sólido de avena modificado de la etapa b) contiene 0,5 g de Ca (NO3)24H2O; 0,2 g de PO4KH2; 0,1 g de SO4Mg 7H2O; 0,1 g de KCl; 5,0 g de sacarosa; 3,5 g de avena en polvo; 0,1 g de extracto de levadura y 8,0 g de agar.

En otro aspecto más en particular de la presente invención, la purificación de la etapa c) se realiza en una placa Petri (1) que contiene otra placa Petri (2) de menor diámetro en su interior dejando un espacio entre ellas (3) en la que se deposita el medio de cultivo MOM, que una vez solidificado el medio se retira la placa Petri (2) de menor tamaño dejando un espacio central (4) donde se deposita el inóculo de micelio.

En un aspecto más en particular de la presente invención el medio BAF modificado de la etapa d) contiene como nutrientes calcio, fósforo, potasio, magnesio, manganeso, zinc, hierro, cloro, azufre, peptona, tiamina, biotina, inositol, ácido fólico, glucosa y levadura. En un aspecto más en particular, el medio BAF modificado de la etapa d) contiene 0,1 g de Cl2Ca; 0,5 g de PO4KH2; 0,5 g de SO4Mg 7H2O; 0,005 g de SO4Mn; 0,001 g de SO4Zn; 0,01 g de Cl3Fe 7H2O; 2,0 g de peptona; 0,0005 g de tiamina; 0,00001 g de biotina; 0,05 g de inositol; 0,0001 g de ácido fólico; 5,0-20,0 g de glucosa y 0,2 g de extracto de levadura. En un aspecto más en particular, el medio BAF modificado de la etapa d) tiene un pH comprendido entre 5-6.5.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra dos perspectivas diferentes 1a y 1b del sistema utilizado para la purificación del micelio fúngico.

La figura 1a corresponde a una placa de Petri de un diámetro de 9 cm (1) en cuyo fondo se coloca de forma centrada una placa (2) de 5 cm de diámetro, que se muestra con trazo discontinuo. Como resultado de esta configuración entre ambas placas se crea un espacio circular de 2 cm de ancho (3) en el que se deposita el medio de cultivo fundido.

La figura 1b muestra el espacio central (4) que queda cuando, una vez enfriado el medio, se retira la placa interpuesta. En dicho espacio vacío central es donde se sitúa el inóculo del micelio, que se desarrolla hasta alcanzar la sección periférica (3) donde se encuentra el medio para la purificación, liberándose así de la posible presencia de bacterias, las cuales quedan retenidas en la sección central de las placas, al no poder desarrollarse por ausencia de nutrientes.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención in vitro de micelio en cultivo puro, aislado, tanto de los cuerpos fructíferos de especies fúngicas, como de secciones de raicillas de plantas de alcornoque (Quercus suber) y de jara pringosa (Cistus ladanifer) micorrizadas con hongos.

En la presente invención cuando nos referimos a especies fúngicas de interés comercial nos referimos en general a especies fúngicas de Basidiomicetos como Clytocybe sp. o Macrolepiota sp., y en particular a Amanita caesarea y Boletus aereus.

El proceso se inició aislando, en cámara de flujo laminar, pequeñas secciones de la parte más interna del himenio del píleo de carpóforos maduros de Amanita caesarea y de Boletus aereus, por separado, a los que se les había eliminado previamente la pellis. Seguidamente, se procedió a la inoculación de dichas secciones, en condiciones de máxima asepsia, en cámara de flujo laminar, en placas Petri de plástico de 5 cm de diámetro, previamente esterilizadas en autoclave, a las que se adicionó con anterioridad el medio nutritivo a utilizar: medio de cultivo sólido de avena modificado (MOM) cuya composición/litro de medio fue: 0,5 g de Ca(NO3)24H2O; 0,2 g de PO4KH2; 0,1 g de SO4Mg 7H2O; 0,1 g de KCl; 5,0 g de sacarosa; 3,5 g de avena en polvo; 0,1 g de extracto de levadura y 8,0 g de agar. Estas placas se mantuvieron en cámara a 20ºC hasta que el micelio se desarrolló, llegando a ocupar toda la superficie de la placa.

El proceso anteriormente descrito se realizó igualmente utilizando como inóculo, secciones de raicillas aisladas de ejemplares de las citadas especies vegetales que previamente habían sido micorrizados con Amanita caesarea y Boletus aereus, y en las que mediante examen al microscopio óptico se había comprobado la existencia de micorrizas de dichos hongos.

Posteriormente, el micelio obtenido en ambos casos, se sometió a un proceso de purificación, con objeto de eliminar la posibilidad de existencia de contaminación bacteriana, utilizándose para ello placas Petri de 9 cm de diámetro en las que el medio de cultivo (el medio MOM anteriormente descrito) se dispuso solamente en una sección circular periférica de 2 cm (placas preparadas con la ayuda de placas de 5 cm de diámetro, tal como se muestra en la figura 1). En la parte central de estas placas se colocaron secciones de 1x1 cm del medio sólido de crecimiento MOM conteniendo el micelio fúngico. Estas placas se mantuvieron en cámara a 20ºC hasta que el micelio se desarrolló ocupando toda la superficie de la placa.

Una vez purificado el micelio se transfirió una pequeña porción de éste, para su...

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento de obtención in vitro de micelio fúngico en cultivo puro que comprende las siguientes etapas:

a) Aislamiento del micelio fúngico,
b) Inoculación del micelio aislado en la etapa a) en un medio de cultivo sólido de avena modificado (MOM)
c) Purificación del micelio,
d) Desarrollo del micelio purificado en la etapa c) en un medio de cultivo Biotina-Aneurina-Ácido Fólico (BAF) modificado,
e) Obtención del micelio fúngico

2. Procedimiento de obtención de micelio fúngico según la reivindicación 1, donde el aislamiento del micelio fúngico se realiza a partir de cuerpos fructíferos de hongos.

3. Procedimiento de obtención de micelio fúngico según la reivindicación 2, donde el hongo a partir del cual se obtiene el micelio es seleccionado de entre los géneros Boletus y Amanita.

4. Procedimiento de obtención de micelio fúngico según la reivindicación 3, donde el hongo a partir del cual se obtiene el micelio es Amanita caesarea.

5. Procedimiento de obtención de micelio fúngico según la reivindicación 3, donde el hongo a partir del cual se obtiene el micelio es Boletus aereus.

6. Procedimiento de obtención de micelio fúngico según la reivindicación 1, donde el aislamiento del micelio fúngico se realiza a partir de secciones de raicillas de plantas micorrizadas.

7. Procedimiento de obtención de micelio fúngico según la reivindicación 6, donde las plantas a partir de las cuales es obtenido el micelio es seleccionado de entre los géneros Quercus, o Cistus.

8. Procedimiento de obtención de micelio fúngico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el medio de cultivo sólido de avena modificada (MOM) de la etapa b) contiene como nutrientes calcio, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, cloro, azufre, sacarosa, levadura y agar.

9. Procedimiento de obtención de micelio fúngico según la reivindicación 8, donde el medio de cultivo sólido de avena modificado de la etapa b) contiene entre 0,5 g de Ca(NO3)2 4H2O; 0,2 g de PO4KH2; 0,1 g de SO4Mg 7H2O; 0,1 g de KCl; 5,0 g de Sacarosa; 3,5 g de avena en polvo; 0,1 g de extracto de levadura y 8,0 g de agar.

10. Procedimiento de obtención de micelio fúngico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la purificación de la etapa c) se realiza en una placa Petri (1) que contiene otra placa Petri (2) de menor diámetro en su interior dejando un espacio entre ellas (3) en el que se deposita el medio de cultivo MOM que una vez solidificado el medio se retira la placa Petri (2) de menor tamaño dejando un espacio circular (4) donde se deposita el inóculo de micelio.

11. Procedimiento de obtención de micelio fúngico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el medio líquido BAF modificado de la etapa d) contiene como nutrientes calcio, fósforo, potasio, magnesio, manganeso, zinc, hierro, cloro, azufre, peptona, tiamina, biotina, inositol, ácido fólico, glucosa y levadura.

12. Procedimiento de obtención de micelio fúngico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el medio BAF modificado de la etapa d) contiene 0,1 g de Cl2Ca; 0,5 g de PO4KH2; 0,5 g de SO4Mg 7H2O; 0,005 g de SO4Mn; 0,001 g de SO4Zn; 0,01 g de Cl3Fe 7H2O; 2,0 g de peptona; 0,0005 g de tiamina; 0,00001 g de biotina; 0,05 g de inositol; 0,0001 g de ácido fólico; 5,0-20,0 g de glucosa, y 0,2 g de extracto de levadura,

13. Procedimiento de obtención de micelio fúngico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el medio líquido BAF modificado de la etapa d) tiene un pH comprendido entre 5-6.5.


 

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