PROTEINAS QUE POSEEN ACTIVIDAD AROMATICO-ACILTRANSFERASA; UN SISTEMA DE GENES QUE LAS CODIFICA;

UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE LAS PROTEINAS UTILIZANDO EL SISTEMA DE GENES; Y USOS DE LOS GENES Y DE LAS PROTEINAS. LOS GENES Y LAS PROTEINAS ACILAN PIGMENTOS DE PLANTAS TALES COMO ANTOCIANINA, CAUSANDO CAMBIOS DEL TONO DEL COLOR, OBTENIENDOSE DE ESTE MODO PLANTAS, EN PARTICULAR FLORES, CON COLORES QUE NO LES SON INHERENTES

Genes que codifican proteínas que tienen actividad aciltransferasa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a secuencias aisladas de ADN que codifican proteínas que tienen actividad transferasa de grupos acilo aromáticos y al uso de las mismas, tal y como se define en las reivindicaciones. Más particularmente, la presente invención se refiere a secuencias aisladas de ADN que codifican proteínas que tienen actividad transferasa de grupos acilo aromáticos, obtenidas a partir de gencianas (Gentiana triflora, var. Japonica), petunias (Petunia hybrida), perillas (Perilla ocymoides), cinerarias (Senecio cruentus) y lavandas (Lavandula angustifolia) y al uso de las mismas tal y como se define en las reivindicaciones.

Técnica anterior

La industria floral está haciendo esfuerzos para desarrollar variedades nuevas y diversas. Un método eficaz para producir una nueva variedad implica cambiar el color de una flor, para lo cual se han empleado los métodos de cultivo tradicionales para producir una amplia variedad de colores para casi todas las variedades comerciales. Sin embargo, con los métodos anteriores, es raro que una sola especie produzca variedades de color que promuevan una amplia gama de colores diferentes, ya que para cada especie hay un grupo de genes limitado.

Los colores de las flores se basan principalmente en dos tipos de pigmentos, los flavonoides y los carotenoides. Los flavonoides confieren principalmente colores en la gama del amarillo al rojo y azul, mientras que los carotenoides confieren los tonos naranjas o amarillos. Las moléculas de los flavonoides que más contribuyen al color de las flores son las antocianinas que son glicósidos de cianidina, delfinidina, petunidina, peonidina, malvidina y pelargonidina. Diferentes antocianinas imparten cambios evidentes en el color de las flores. Además, el color de las flores está afectado por la copigmentación con flavonoides incoloros, la formación de complejos metálicos, la glicosilación, la acilación, la metilación y el pH de las vacuolas (Forkman, Plant Breeding 106: 1, 1991).

Existe una pluralidad de artículos sobre antocianinas aciladas, aisladas en la naturaleza que incluyen cinerarina, obtenida a partir de las cinerarias (Senecio cruentus) (Goto y col., Tetrahedron 25: 6021, 1984), awobanina obtenida a partir de Commelina communis (Goto y Kondo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30: 17, 1991) y gentiodelfina, obtenida a partir de Gentiana makinoi (Yoshida y col., Tetrahedron 48: 4313, 1992) (Monarda didyma: Kondo y col., Tetrahedron 26: 5879, 1985; perillas, pensamientos (Goto y col., Tetrahedron 27: 2413, 1987); amor de hombre: Idaka y col., Tetrahedron 28: 1901, 1987; Dioscorea japonica: Shoyama y col., Phytochemistry 29: 2999, 1990; lombarda, Platycodon grandiflorum, lobelia, delfinios, centros: Goto y Kondo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30: 17, 1991; zanahorias: Glabgen y col., Phytochemistry 31: 1593, 1992; ipomoea: Lu y col., Phytochemistry 32: 659, 1992; Saito y col., Phytochemistry 40: 1283, 1995; Ajuga decumbens, Clinopodium gracile, Lamiums, lavanda, nepeta, Leonurus macranthus, Plectranthus, Prunellas, Salvia splendens Sella, crosne del Japón: Saito y Harborne, Phytochemistry 31: 3009, 1992; nenúfar gigante: Strack y col., Phytochemistry 31: 989, 1992; campanillas: Brandt y col., 33: 209, 1993; gencianas: Hosokawa y col., Phytochemistry 40: 941, 1995; jacintos: Hosokawa y col., Phytochemistry 40: 567, 1995).

Los grupos acilo que modifican estos flavonoides que contienen antocianinas, se dividen en dos clases, basándose en su estructura: una es la de los grupos acilo aromáticos que se centran en ácidos hidroxi cinnámicos y la otra clase es la de los grupos acilo alifáticos, tales como el grupo malonilo. Se ha observado en el experimento que emplea el pigmento antocianina de las ipomoea nil (Pharbitis nil), que entre las reacciones de transferencia de grupos acilo, las antocianinas a las que se une un grupo acilo aromático, preferentemente ácido cumárico o ácido cafeico, muestran un desplazamiento del máximo de absorción a la longitud de onda lateral (Dangle y col., Phytochemistry 34: 1119, 1993).

Además, para la cineranina obtenida a partir de cineraria (Senecio cruentus) que sólo tiene un grupo acilo alifático y tres grupos acilo aromáticos, se ha descrito que la estabilidad del pigmento disminuye en una solución acuosa neutra, eliminando los grupos acilo aromáticos (Goto y col., Tetrahedron 25: 6021, 1984). Para la genciodelfina obtenida a partir de gencianas (Gentiana makinoi), también se ha descrito que tiene lugar un apilamiento intramolecular de tipo sándwich, debido a la presencia de dos grupos acilo aromáticos en la molécula, lo que produce una estabilización del pigmento en una solución acuosa (Yoshida y col., Tetrahedron 48: 4313, 1992). Además, Yoshida y col. han mostrado que cada glucosa en la posición 5 y cada glucosa en la posición 3' de la antocianina, tienen un grupo acilo unido a las mismas (Tetrahedron 48: 4313, 1992). También se ha descrito que la antocianina en las hojas de perillas (Perilla ocymoides) es shisonin en la que el ácido cumárico está unido a glucosa en la posición 3 del 3,5-diglucósido de cianidina (Tetrahedron Letters 27: 2413-2416, 1978).

Sin embargo, estos estudios se han desarrollado desde el punto de vista de la química orgánica, tal como estudios estructurales de pigmentos naturales, y no desde el punto de vista de la bioquímica, como los esfuerzos para aislar enzimas que transfieren grupos acilo.

De las transferasas que transfieren grupos acilo a los pigmentos de antocianina, hay muchos estudios sobre las transferasas de grupos malonilo que transfieren un acilo alifático, incluyendo las procedentes de un cultivo celular de perejil (Matern y col., Arch. Biochem. Biophys. 208: 233, 1981; Matern y col., Arch. Biochem. Biophys. 226: 206, 1983; Matern y col., Eur. J. Biochem. 133: 439, 1983), de semillas de Cicer arientium (Koster y col., Arch. Biochem. Biophys. 234: 513, 1984) y similares.

La reacción de transferencia de acilos aromáticos fue descrita en primer lugar para silene, un miembro de las Caryophyllaceae (Kamsteeg y col., Biochem. Physiol. Pflanzen 175: 403, 1980), y la actividad aciltransferasa aromática se encontró de forma similar en la fracción soluble enzimática de Matthiola (Teusch y col., Phytochemistry 26: 991, 1986).

Sin embargo, estos estudios se han limitado a una mera demostración de la presencia de actividad enzimática y no se han especificado las proteínas enzimáticas correspondientes, ni se ha obtenido una determinación de las propiedades de la estructura primaria de las enzimas, aún menos los genes que las codifican. Para otras transferasas de acilos aromáticos, los estudios no han aclarado tampoco la estructura primaria de las proteínas o los genes. Adicionalmente, no hay informes de ejemplos en los que las reacciones de acilación de pigmentos de antocianina se emplearan de forma positiva para expandir la gama de colores de las flores y para hacerlas crecer, o ejemplos en los que la acilación se empleaba en un intento de estabilizar las antocianinas.

Por otro lado, la ruta bioquímica de la síntesis de antocianinas de Petunia hybrida está bien estudiada (Wiering, H. y de Vlaming, P. Inheritance and biochemistry of pigments. Petunia, P49-65 (1984), Griesbach, R.J., Asen, S. y Leonhardt, B.A., Phytochemistry, 30: 1729-1731, 1991), y es conocida la presencia de antocianinas que contienen un grupo acilo. Como grupo acilo de las antocianinas de Petunia, se conoce el ácido cumárico o el ácido cafeico. Una molécula de ácido cumárico o ácido cafeico está unida a una rutinosida en la posición 3 de la antocianina, cuya estructura química asignada, cuando la antocianidina es malvidina, es 3-O-(6-O-(4-O-cumaroil)-a-D-glucopiranosil)-5-O-ß-D-glucopiranosil-malvidina y 3-O-(6-O-(4-O-cafeoil)-a-D-glucopiranosil)-5-O-ß-D-glucopiranosil-malvidina, respectivamente. Sin embargo, no había información sobre antocianinas que tuvieran dos grupos acilo.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de ADN aisladas tal y como se definen en las reivindicaciones, que codifican proteínas que tienen actividad transferasa de grupos acilo aromáticos y al uso de las mismas, tal y como se define en las reivindicaciones. Por tanto, en relación con dicho uso, se describe un método para controlar una reacción de transferencia de un grupo acilo a flavonoides, preferentemente antocianinas, que proporciona...

1. Una secuencia de ADN aislada que codifica una proteína de origen vegetal que tiene actividad para transferir un grupo acilo aromático a un flavonoide o a un derivado de una proteína tal, que es un derivado que tiene dicha actividad enzimática, teniendo dicha proteína o derivado una homología de al menos 15% o superior con el conjunto de cualquiera de las secuencias de aminoácidos tal y como se expone en SEQ ID No. 1 a 6.

2. La secuencia de ADN aislada según la reivindicación 1, obtenible por clonación empleando como cebador una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos tal y como se describe en SEQ ID No. 21.

3. La secuencia de ADN aislada según la reivindicación 2, en la que dicho cebador tiene la secuencia de nucleótidos tal y como se describe en SEQ ID No. 22.

4. La secuencia de ADN aislada según la reivindicación 1 ó 2, que codifica cualquiera de las secuencias de aminoácidos tal y como se describen en SEQ ID No. 1 a 6.

5. La secuencia de ADN aislada según la reivindicación 1 ó 2, que codifica una proteína, cuya secuencia de ADN es capaz de hibridarse con la secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las secuencias de aminoácidos tal y como se describen en SEQ ID No. 1 a 6, con los requerimientos de 5 x SSC y 50ºC y cuya proteína tiene actividad para transferir un grupo acilo aromático a un flavonoide.

6. La secuencia de ADN aislada según la reivindicación 1 ó 2, que codifica una proteína, cuya secuencia de ADN es capaz de hibridarse con la secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las secuencias de aminoácidos tal y como se describen en SEQ ID No. 1 a 6, con los requerimientos de 2 x SSC y 50ºC y cuya proteína tiene actividad para transferir un grupo acilo aromático a un flavonoide.

7. La secuencia de ADN aislada según la reivindicación 1 ó 2, que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos 30% o superior con cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID No. 1 a 6, y que tiene actividad para transferir un grupo acilo aromático a un flavonoide.

8. Un vector que comprende una secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un hospedador, distinto de un ser humano, transformado con un vector según la reivindicación 8.

10. Un hospedador según la reivindicación 9, en donde dicho hospedador es una célula microbiana o animal.

11. Un hospedador según la reivindicación 9, en donde dicho hospedador es una célula vegetal o un cuerpo vegetal.

12. Proteína codificada por una secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene actividad para transferir un grupo acilo aromático a un flavonoide.

13. Un método para producir una proteína que tiene actividad para transferir un grupo acilo aromático a un flavonoide, en el que un hospedador de acuerdo con la reivindicación 9, se cultiva o se hace crecer y, a continuación, una proteína que tiene dicha actividad de transferencia de un grupo acilo aromático a un flavonoide, se recupera a partir de dicho hospedador.

14. Un método para acilar un pigmento, que comprende someter dicho pigmento a la acción de la proteína según la reivindicación 12.

15. Un método para acilar un pigmento en una planta, que comprende las etapas de introducir un gen según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en una planta, permitir la expresión de dicho gen y acilar el pigmento en la planta con la proteína producida.

16. Un método para estabilizar un pigmento, en donde dicho pigmento está acilado por la acción de la proteína de acuerdo con la reivindicación 12.

17. Un método para estabilizar un pigmento en una planta, que comprende las etapas de introducir la secuencia de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en una planta, permitir la expresión de dicha secuencia y acilar el pigmento en la planta con la proteína producida.

18. Un método para controlar el color de las flores, que comprende las etapas de introducir la secuencia de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en una planta, permitir que dicha secuencia de ADN se exprese y acilar el pigmento en la planta con la proteína producida.

19. El método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que el pigmento es antocianina.

20. Una planta cuyo color se ha controlado introduciendo en ella una secuencia de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o su progenie que tiene la misma propiedad, o tejidos de la misma, en donde la estructura de los flavonoides de la planta en la que se ha introducido la secuencia de ADN, se ha modificado en relación con las estructuras de los flavonoides de plantas en las que no se ha introducido la secuencia de ADN.

21. El tejido vegetal según la reivindicación 20, en el que dicho tejido es una flor.

22. Una flor cortada de la planta según la reivindicación 20, o su descendencia, que tiene la misma propiedad.