FAMILIA DE PROTEINAS EE3 Y SECUENCIAS DE ADN CORRESPONDIENTES.

Ácido nucleico, caracterizado porque se codifica para un polipéptido conforme a una de las Figuras 13 o 15A,

o para variantes de éste, que tengan en el plano de aminoácidos al menos un 90% de la identidad respecto a un polipéptido conforme a una de las Figuras 13 o 15A, excepto un ácido nucleico conforme a la SEC ID NO:75 de la WO01/98353

Familia de proteínas EE3 y secuencias de ADN correspondientes.

La presente invención se relaciona con

Gracias al estado actual de la técnica se conocen numerosas proteínas, que pertenecen a la clase de los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs). Se trata además de la mayor familia de moléculas superficiales, involucradas en la transducción de señales. Son activadas por una gran variedad de ligandos y otros estímulos, por ejemplo, luz (rodopsina), olores (receptores de odorantes), calcio, aminoácidos o aminas biogénicas, nucleótidos, péptidos, - y derivados, y diferentes polipéptidos. En los mamíferos, se basa en que existen aprox. 1500 proteínas diferentes de la clase de las GPCRs, codificando aprox. 1200 para receptores de olor, de sabor o deleronasales. El número total de GPCRs "huérfanos" (o sea receptores, a los que no podía asignarse hasta ahora ninguna funcionalidad) se estima en 200-500 (Howard AD, McAllister G, proteína-coupled receptors and natural ligand discovery. Textoremoscias farmacol Sci 22:132-140.). En la Caenorhabditis elegans, las secuencias de GPCR componen aprox. un 5% del genoma y codifican para aprox. 1000 proteínas GPCR (Bargmann CI (1998) Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome. Science 282:2028-2033 y Bargmann CI, Kaplan JM (1998) Señal transducción en the Caenorhabditis elegans nervous System. Annu Rev Neurosci 21: 279-308).

Para la Drosofila melanogaster hay conocimientos gracias al estado actual de la técnica de que existen aprox. 200 secuencias de GPCR (Brody T, Cravchik A (2000) Drosofila melanogaster G proteína-coupled receptors. J Cell Biol 150:83-88). Se parte del hecho de que este gran grupo de moléculas topológicamente similares se ha desarrollado convergentemente, es decir, con el fin del acoplamiento a proteínas G.

La clase de las GPCRs se subdivide en 3 ó 4 familias según el estado actual de la técnica. La familia A tiene además la gran mayoría de miembros, a ellos pertenecen por ejemplo, también los receptores de odorantes (Buck L, Axel R (1991) A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular base for odor recognición. Cell 65:175-187.). A la familia B pertenecen los receptores para secretina, VIP, y calcitonina. La familia C consiste en receptores como los receptores metabotrópicos del glutamato, los receptores del calcio, los receptores del GABA-B, los receptores del sabor, y los receptores de la feromona. Casi todas las denominadas secuencias "huérfanas" de GPCR pertenecen, sin embargo, a la familia A.

Una característica de las familias de GPCR es su transducción de señales a través de las proteínas G. El enlace de un ligando extracelular induce la activación de una proteína G, que reexpide entonces la señal. Hay aprox. 200 proteínas G diferentes, y cada tipo de célula puede tener otra dotación. La forma activa de una proteína G es la ligada al GTP, en estado inactivo la proteína G está ligada al GDP. La propia proteína G conlleva además su inactivación tras el enlace al GTP, ya que representa una GTPasa. Por tanto, la transducción de señales a través de proteínas G es siempre un acontecimiento trasiente. Cada proteína G consiste en 3 subunidades, alfa, beta y gamma. Además, la subunidad alfa puede ligar al GTP y puede controlar, por tanto, considerablemente las moléculas de señalización de la parte inferior de la cascada de señales ("second messenger" systems - sistemas de segundo mensajero). La proteína G Gs, por ejemplo, activa (estimula) la adenilato ciclasa y conlleva así un aumento de la concentración del mensajero intracelular cAMP. La proteína G Gi inhibe la adenilato ciclasa, y la Gq activa a la fosfolipasa C ("segundo mensajero": inositoltrifosfato y diacilglicerol). Otros sistemas segundo mensajero frecuentemente empleados son, por ejemplo, calcio, K, cGMP, y otros. Hay también proteínas G quiméricas. Las subunidades G beta y gamma pueden conducir asimismo a una transducción de señales, después de que se hayan desacoplado del complejo proteico trimérico, por ejemplo, posiblemente durante la activación de las rutas de señal de la MAP quinasa. La especificidad del acoplamiento a la proteína G de un determinado GPCR representa una importante característica farmacológica, que puede aprovecharse, entre otros, para el desarrollo del ensayo, típicamente con determinación de las variaciones de la concentración de las moléculas de señalización de la parte inferior de la cascada de señales, por ejemplo, calcio, cAMP o inositoltrifosfato. Sólo recientemente se ha encontrado en la literatura, con los resultados preliminares, también la observación de las rutas de señal de la MAP quinasa, que pueden transferir asimismo señales de GPCR (Marinissen MJ, Gutkind JS (2001) G-protein-coupled receptors and signaling networks: emerging paradigms. Trends Pharmacol Sci 22:368-376.).

Finalmente es también en principio posible una transducción de señales independiente de la proteína G. así por ejemplo, modula la interacción directa del receptor de beta-2-adrenérgicos con la proteína NHERF la actividad de un intercambiador de Na/H (Hall RA, Premont RT, Chow CW, Blitzer JT, Pitcher JA, Claing A, Sustanciasl RH, Barak LS, Shenolikar S, Weinman EJ, Grinstein S, Lefkowitz RJ (1998) The beta2-adrenergic receptor interacts with the Na+/H+-exchanger regulatory factor to control Na+/H+ exchange. Nature 392:626-630).

Otra característica, que se aplica a muchos, cuando no a todos, los receptores de GPCR- son las oligomerizaciones. Especialmente interesantes son, en este contexto, las heterodimerizaciones entre diferentes GPCRs, que pueden modificar el perfil farmacológico y la especificidad de los ligandos (Bouvier M (2001) oligomerización of G-proteína-coupled transcentror receptors. Nat Rev Neurosci 2:274-286). Así funciona por ejemplo, el receptor de GABA-B sólo como heterodímero entre GBR1 y GBR2 (Kuner R, Kohr G, Grunewald S, Aquírohardt G, Bach A, Granoau HC (1999) Role of heteromer formation en GABAB receptor funcion. Science 283:74-77). Una heterodimerización de este tipo describiría entretanto para una serie completa de GPCRs, por ejemplo, el mGluR5, el receptor de delta-opioide, y otros. Sólo recientemente se ha documentado en el caso de la preclampsia, que la elevada expresión de un participante en un par de heterodímeros de GPCR puede conducir a una enfermedad. Aquí conlleva la elevada expresión del receptor de Bradykinin-II una formación reforzada de Heterodímeros receptores de BradykininII-AngiotensinaII, cuya respuesta farmacológica modificada puede aclara el fenotipo hipertónico (AbdAlla, Lother, Massiery y Quitterer, Nat. Medicine (2001), 7, 1003-1009).

Finalmente, en el caso de las proteínas de la clase GPCR se trata de una molécula diana farmacológica preferente. En el caso de las proteínas de la clase GPCR se afectan farmacológicamente más del 25% de los 100 medicamentos superventas (Flower et al., 1999, Biochim. Biofys. Acta, 1422, 207-234). Así son particularmente agonistas y antagonistas para los siguientes grupos de receptores de mayor importancia farmacológica: el grupo de los adrenoreceptores, del receptor de la angiotensina-II, receptores de la serotonina, receptores de la dopamina, receptores de la histamina, receptores del leucotrieno/prostaglandina. Los fármacos, que en influyen estos receptores, cubren...

1. Ácido nucleico, caracterizado porque se codifica para un polipéptido conforme a una de las Figuras 13 o 15A, o para variantes de éste, que tengan en el plano de aminoácidos al menos un 90% de la identidad respecto a un polipéptido conforme a una de las Figuras 13 o 15A, excepto un ácido nucleico conforme a la SEC ID NO:75 de la WO01/98353.

2. Ácido nucleico según la Reivindicación 1, caracterizado porque contiene una secuencia conforme a una de las Figuras 9A o 11 A para el dominio traducido (en mayúsculas).

3. Vector de expresión, caracterizado porque contiene una secuencia de ADN según al menos una de las reivindicaciones 1 o 2.

4. Célula huésped, caracterizada por estar transformada con un vector de expresión según la Reivindicación 3.

5. Célula huésped según la Reivindicación 4, caracterizada por ser una célula mamaria, particularmente una célula humana.

6. Producto génico purificado, caracterizado porque se codifica mediante una secuencia de ADN según al menos una de las reivindicaciones 1 o 2, excepto un polipéptido conforme a la SEC ID NO:31 de la WO01/98353.

7. Producto génico purificado según la Reivindicación 6, caracterizado porque es un polipéptido.

8. Animal transgénico no-humano, caracterizado porque le falta su polipéptido ee3-1 nativo conforme a la Reivindicación 7 o partes del mismo.

9. Anticuerpo, caracterizado porque reconoce un epítope de un producto génico según al menos una de las reivindicaciones 6 o 7.

10. Anticuerpo según la Reivindicación 9, caracterizado porque es monoclonal.

11. Anticuerpo según al menos una de las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque está dirigido contra una fracción de secuencia del dominio extracelular como epítope.

12. Procedimiento para la expresión de productos génicos según al menos una de las reivindicaciones 6 o 7, caracterizado porque las células huésped se transforman con un vector de expresión según la Reivindicación 3.

13. Procedimiento para el aislamiento de productos génicos según al menos una de las reivindicaciones 6 o 7, caracterizado porque las células huésped según la Reivindicación 4 o 5 se cultivan en condiciones apropiadas, favorecedoras de la expresión y el producto génico se limpia, a continuación, del cultivo.

14. Ácido nucleico según al menos una de las reivindicaciones 1 o 2 o un producto génico según al menos una de las reivindicaciones 6 o 7 como fármaco.

15. Ácido nucleico según al menos una de las reivindicaciones 1 o 2 o producto génico según al menos una de las reivindicaciones 6 o 7 para el tratamiento de enfermedades neurológicas.

16. Procedimiento para la identificación de un participante de la interacción celular de un polipéptido, codificado por un ácido nucleico según al menos una de las reivindicaciones 1 o 2, empleándose un denominado sistema "yeast-two-hybrid".