FACTOR VIII ESTABILIZADO CON ENLACES DISULFURO MODIFICADOS GENETICAMENTE.

Un factor VIII mutante que comprende al menos un par de cisteínas localizadas en restos seleccionados del grupo que consiste en Met662-Asp1828 y Tyr664-Thr1826

Factor VIII estabilizado con enlaces disulfuro modificados genéticamente.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para introducir uno o más restos cisteína en un polipéptido que permite la estabilización del polipéptido mediante la formación de al menos un enlace, preferiblemente un enlace disulfuro, entre diferentes dominio del polipéptido. La invención también se refiere a un polipéptido que contiene dicho resto o restos cisteínas introducidos, a ácido nucleicos que codifican dichos polipéptidos, y a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos polipéptidos o ácidos nucleicos. La invención también se refiere a vectores, partículas víricas y células hospedantes que contienen dichos ácidos nucleicos, y a métodos que los utilizan para producir los polipéptidos de la invención.

Antecedentes de la invención

Se conocen muchos polipéptidos que son el producto de la expresión de un único gen. Una serie de estos polipéptidos se han sintetizado en un principio como una única cadena polipeptídica, pero contienen múltiples dominios plegados de forma independiente que se someten a una proteolisis limitada (o a una o varias rupturas proteolíticas) in vivo que puede dar como resultado la separación de los dominios debido a la disociación de los productos de ruptura. Se ha demostrado que la proteolisis que produce la separación de los dominios altera la estabilidad y/o las actividades enzimáticas o funcionales de una diversidad de estas proteínas. Los ejemplos de estas proteínas incluyen proteínas plasmáticas, como las implicadas en la coagulación sanguínea.

Tal como se conoce en la técnica, la coagulación sanguínea comienza cuando las plaquetas se adhieren a la pared de un vaso sanguíneo dañado en un sitio de lesión. Posteriormente, en una cascada de reacciones reguladas enzimáticamente, las moléculas de fibrinógeno solubles son convertidas por la enzima trombina en cadenas insolubles de fibrina que mantienen juntas a las plaquetas en un trombo. En cada etapa de la cascada, un precursor de proteasa se convierte en una proteasa que rompe el siguiente precursor de proteína en la serie. Se requieren cofactores en la mayoría de las etapas. En su forma activa, la proteína del factor VIII es un cofactor que es necesario para la activación del factor X por la proteasa, el factor activado IX.

El factor VIII puede ser activado para formar el factor VIIIa (en el que "a" indica "activado") de manera proteolítica por la trombina o el factor Xa. En combinación con el calcio y fosfolípidos, el factor VIIIa hace que el factor IXa sea un activador más eficaz del factor X mediante un mecanismo que aún no se comprende por completo.

Las personas deficientes en el factor VIII o que tienen anticuerpos contra el factor VIII que no son tratadas con el factor VIII sufren sangrados internos incontrolados que pueden provocar una gama de síntomas graves, desde reacciones inflamatorias en las articulaciones a una muerte temprana. Los hemofílicos graves, que en EEUU son aproximadamente 10.000, pueden tratarse con una infusión del factor VIII, que restablece la capacidad de coagulación normal de la sangre si se administra con la frecuencia y la concentración suficientes.

Varias preparaciones de factor VIII derivado de plasma humano o recombinante de diversos grados de pureza están disponibles en el mercado para el tratamiento de la hemofilia A. Éstas incluyen un factor VIII parcialmente purificado derivado de sangre reunida de muchos donantes que está tratada con detergentes y con calor para destruir los virus pero que contiene un nivel significativo de proteínas antigénicas; un factor VIII purificado con anticuerpos monoclonales que tiene unos niveles menores de impurezas antigénicas y contaminación vírica; y el factor VIII humano recombinante.

Los hemofílicos requieren la reposición diaria del factor VIII para evitar la artropatía hemofílica deformante que se produce después de muchos años de hemorragias recurrentes en las articulaciones. Sin embargo, los suministros de concentrados del factor VIII nunca han sido suficientes para tratar a los hemofílicos de forma adecuada, debido a los problemas en la producción comercial y el uso terapéutico. Por ejemplo, el factor VIII derivado de plasma que se utiliza habitualmente es difícil de aislar y purificar, es inmunogénico, y requiere un tratamiento para eliminar el riesgo de infectividad por el virus del SIDA y de la hepatitis. El factor VIII porcino también puede ser una alternativa, pero una limitación en el factor VIII porcino es el desarrollo de anticuerpos inhibidores contra éste después de una o más infusiones.

El factor VIII activado (FVIIIa) es termodinámicamente inestable bajo condiciones fisiológicas debido a la tendencia del dominio A2 a disociarse del resto del complejo. En otras palabras, el FVIII activado se inactiva espontáneamente. Si esta disociación pudiese evitarse en las preparaciones farmacológicas de FVIII o FVIIIa, podría realizarse una administración menos frecuente y/o a menor concentración. Esto podría producir una serie de beneficios, como ahorro de costes, un menor uso de personal médico, y una mejor calidad de vida para los hemofílicos.

Otra proteína plasmática, además del factor VIII, es la protrombina. Como parte de la cascada de la coagulación, la protrombina se convierte en trombina por la acción del complejo de protrombinasa (FXa, FVa y Ca²⁺). En la protrombina humana, esta conversión implica la ruptura en Arg271 y Arg284, entre el dominio F2 y la cadena A de trombina, y en Arg320, entre las cadenas A y B (sistema de numeración humano). In vivo, la protrombinasa rompe primero la protrombina en Arg320, produciendo la meizotrombina. La meizotrombina libre es un intermedio inestable, y la autolisis en el enlace Arg155-Ser156 elimina rápidamente el dominio F1 para generar meizotrombina (des F1), que lentamente se convierte en trombina mediante las rupturas en Arg271 y Arg284. En presencia de trombomodulina y vesículas de fosfolípidos de fosfatidilserina/fosfatidilcolina (PCPS), la meizotrombina y la meizotrombina (des F1) son mejores activadores de la proteína C que la trombina (41, 42).

Otra proteína plasmática es el factor V. El factor V de la coagulación humano (FV) es una proteína de PM 330.000, que está compuesta por seis dominios de tres tipos en el orden A1-A2-B-A3-C1-C2 (4). La trombina rompe el FV para eliminar la mayor parte del dominio B y producir FV activado (FVa). El FVa humano está compuesto por una cadena pesada (A1-A2, restos 1-709) y una cadena ligera (A3-C1-C2, restos 1546-2196), que forma un complejo no covalente (5). El FVa es un cofactor no enzimático para el factor Xa (FXa) en el complejo de protrombinasa, que convierte la protrombina en trombina, en presencia de fosfolípidos cargados negativamente (6). La inactivación del FVa es un proceso complejo que implica rupturas por APC (proteína C activada) del FVa en Arg506, Arg306 y Arg679. La ruptura en Arg506 es más rápida que la ruptura en Arg306 e inactiva sólo parcialmente el FVa, mientras que la ruptura en Arg306 inactiva completamente el FVa y provoca la disociación de los fragmentos del dominio A2 (7-10). El FVa totalmente inactivado pierde su capacidad para unirse a FXa (11).

Otra proteína plasmática es el factor XII. El FXII humano es una proteína monocatenaria con un PM de 76.000 y 596 aminoácidos. Contiene, en orden desde el N-terminal al C-terminal, un dominio fibronectina de tipo II, un dominio EGF, un dominio fibronectina de tipo I, un dominio EGF, un dominio Kringle, un dominio serina-proteasa de tipo tripsina. Existen al menos dos formas del factor XII activado (FXIIa). El aFXIIa está formado por la ruptura del enlace tras Arg353, generando una molécula bicatenaria formada por una cadena pesada (353 restos) y una cadena ligera (243 restos) mantenidas juntas por un enlace disulfuro. Una posterior ruptura produce FXIIa (fragmento de FXIIa). Esto es el resultado de la ruptura en Arg334 y Arg343, que produce dos cadenas polipeptídicas (9 y 243 restos) que se mantienen juntas mediante un enlace disulfuro (43, 44). La mayor parte del fragmento de cadena pesada N-terminal ya no está asociado. La unión negativa a superficies/membranas es mediada a través de esta cadena pesada, de forma que el fragmento FXIIa resultante ya no se une a superficies pero aún es catalíticamente activo.

La proteína HGFA (activador del factor del crecimiento de hepatocitos) tiene la misma estructura de dominios que el FXII (45) y también es activada por la ruptura proteolítica, pero en este caso sólo la trombina la...

1. Un factor VIII mutante que comprende al menos un par de cisteínas localizadas en restos seleccionados del grupo que consiste en Met662-Asp1828 y Tyr664-Thr1826.

2. Un ácido nucleico que codifica el factor VIII mutante según la reivindicación 1.

3. Un vector, una célula hospedante o una composición que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 2.

4. Una composición que comprende el factor VIII mutante según la reivindicación 1.

5. Una composición farmacéutica que comprende el factor VIII mutante según la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico, un vector o un virión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el factor VIII mutante según la reivindicación 1, unida operablemente a elementos de control de la expresión.

7. Un primer ácido nucleico, vector o virión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera del factor VIII mutante según la reivindicación 1, unida operablemente a elementos de control de la expresión, y un segundo ácido nucleico, vector o virión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada del factor VIII mutante según la reivindicación 1, unida operablemente a elementos de control de la expresión, para su uso como medicamento.

8. Una célula hospedante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el factor VIII mutante según la reivindicación 1, unida operablemente a elementos de control de la expresión, para su uso como medicamento.

9. Una célula hospedante que comprende (i) una primera secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera del factor VIII mutante según la reivindicación 1, unida operablemente a elementos de control de la expresión, y (ii) una segunda secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada del factor VIII mutante según la reivindicación 1, unida operablemente a elementos de control de la expresión, para su uso como medicamento.

10. Una composición farmacéutica que comprende el factor VIII mutante según la reivindicación 1, para tratar un mayor riesgo de sangrado en un sujeto.

11. Una composición farmacéutica que comprende el factor VIII mutante según la reivindicación 1, para potenciar la coagulación sanguínea y/o para tratar la hemofilia en un sujeto.

12. Una composición farmacéutica según la reivindicación 10 u 11, o un medicamento según las reivindicaciones 7 a 9, para su uso para tratar la deficiencia del factor VIII en un mamífero.