ESTRUCTURA MOLECULAR DE RHD NEGATIVO.

Molécula de ácido nucleico que es un gen RHD que comprende una sustitución de un único nucleótido dentro de un sitio de corte y empalme en 5'' o 3'',

en la que dicha sustitución da lugar a una mutación dentro de una secuencia de 4 nucleótidos, una secuencia de 6 nucleótidos o una secuencia de 8 nucleótidos que comprende el sitio de corte y empalme consenso en el límite del exón 9/intrón 9 o en el límite del exón 3/intrón 3 y correlacionándose dicha molécula de ácido nucleico con un fenotipo Del

Estructura molecular de RHD negativo.

La presente invención se refiere a una estructura molecular de ácido nucleico que representa el locus de genes Rhesus que comprende el gen RHD. Adicionalmente, la invención se refiere a un procedimiento para la detección específica de los haplotipos RHD-negativos comunes. La invención se refiere además a la detección de haplotipos RDH-positivos en individuos D-negativos. Se han identificado diversas mutaciones en el gen RHD que permiten el desarrollo de herramientas de diagnóstico. La invención también se refiere a oligonucleótidos. Adicionalmente, la invención se refiere a kits que comprenden o emplean los compuestos de la invención mencionados anterior- mente.

El antígeno Rhesus-D (ISBT 004.001; RH1) es el antígeno de grupo sanguíneo más importante determinado por una proteína. Anti-D sigue siendo la causa principal de enfermedad hemolítica en los recién nacidos (Filbey, Acta Obstet Gynecol Scand, 74:687, 1995; Bowman, J, Semin Perinatol 21:39, 1997). Dependiendo de la población, del 3% al 25% de las personas de raza blanca carecen del antígeno D (Mourant, The distribution of the human sangre groups and other polymorphisms, Londres, Oxford University Press, 1976). Pueden producirse inmunizaciones de anti-D rápidamente en receptores D-negativos (Urbaniak, Transfusion 21:64, 1981).

Los antígenos del grupo sanguíneo RH los portan proteínas codificadas por dos genes, RHD y RHCE, que se ubican en la posición cromosómica 1p34.1 - 1p36 (Cherif-Zahar, Hum. Genet. 86: 398, 1991; MacGeoch, Cytogenet. Cell Genet. 59:261, 1992) probablemente dentro de una distancia inferior a 450.000 pares de bases (pb) (Carritt, Hum. Mol. Genet. 6:843,1997). Ambos genes engloban diez exones y sus estructuras son altamente homólogas. Se desconocían la orientación relativa de los genes, su distancia, y la posibilidad de otros genes intercalados (Flegel, Transfus. Med. 8:281, 1998). Muy recientemente, Okuda et al. (Okuda, Biochem. Biophys. Res. Commun. 263:378, 1999) notificaron una secuencia de aproximadamente 11.000 pb, que se pensó que representaba el segmento de ADN entre RHD y RHCE.

En personas de raza blanca, la amplia mayoría de haplotipos D-negativos se debe a una deleción del gen RHD: Esta deleción abarca el gen RHD completo, porque están ausentes secuencias específicas de RHD que se extienden desde el exón 1 hasta la región no traducida en 3' (Gassner, Transfusion 37:1020, 1997). La extensión exacta de la deleción era incierta, dejando abierta la posibilidad de que también se vieran afectados genes vecinos.

La identificación del gen RHD como la base molecular del antígeno D permitió la predicción del fenotipo de RhD mediante tipificación del ADN (Flegel, Transfus. Med. 8:281, 1998; Lo, Lancet 341:1147, 1993). Sin embargo, puesto que se desconoce la estructura del haplotipo D-negativo prevalente, siguió siendo imposible una detección específica de la deleción de RHD y la discriminación entre individuos homocigóticos RHD⁺/RHD⁺ y heterocigóticos RHD⁺/RHD^- se basó en métodos indirectos. Esta discriminación es de interés clínico en particular, porque en madres D-negativas con un anti-D, el riesgo de un niño afectado es del 100% con un padre RHD⁺/RHD⁺, pero sólo del 50% con un padre RHD⁺/RHD^-.

Se han aplicado varios enfoques indirectos para determinar la cigosidad: (i) una simple conjetura basada en el fenotipo es correcta en aproximadamente el 95% de los casos, (ii) la determinación de la densidad de antígeno D que puede frustrarse por factores tales como la presencia de antígeno C, y (iii) varios métodos que implican la amplificación cuantitativa en paralelo de secuencias específicas de RHD y RHCE (Cossu, Electrophoresis 17:1911, 1996; Döscher, Infusionsther. Transfusionsmed. 26 (supl. 1):31, 1999 (abstr.)). Estas técnicas complicadas pueden no ser prácticas en los laboratorios de rutina. Además, varios investigadores identificaron polimorfismos en el gen RHCE o secuencias vecinas relacionados genéticamente con la carencia del gen RHD (Carritt, Hum. Mol. Genet. 6:843, 1997; Huang, Am. J. Hum. genet. 58: 133, 1996; Fujiwara, Hum. genet. 104:301, 1999; Onda, Gene 159:225,1995). Este enfoque indirecto se basó en el desequilibrio de ligamiento que asocia la deleción de RHD con un polimor- fismo.

Además, la utilidad de PCR de RHD está limitada por el conocimiento incompleto de alelos RHD-positivos presumiblemente raros en RhD-negativo. Los alelos RHD-positivos en RhD-negativo están producidos por genes híbridos RHD-CE-D (Huang, Blood 88:2326-33, 1996; Faas, Transfusion 37:38-44, 1997, Faas, Transfusion 36:506-11, 1996), mutaciones sin sentido (Avent, Blood 89:2568-77, 1997), del marco de lectura (Andrews, Blood 92:1839-40, 1998; Cherif-Zahar Br. J. Haematol. 102:1263-70,1998), o pseudogenes (Singleton, Blood 95:12-8, 2000). Tales alelos son frecuentes en las personas africanas (Faas, Transfusion 37:38-44, 1997, Singleton, Blood 95:12-18, 2000) y asiáticas (Okuda, J. Clin. Invest. 100:373-9,1997) pero son raros en personas de raza blanca. No obstante, análisis recientes (Avent, Blood 89:2568-77, 1997; Flegel, Transfus. Med. 8:281-302, 1998) sugieren que incluso para las personas de raza blanca, estos alelos son probablemente la causa principal de predicción incorrecta del fenotipo de Rh. Varias observaciones en personas de raza blanca (Avent, Blood 89:2568-77, 1997; Hyland, Blood 84:321-4, 1994) indicaron que estos alelos se agruparon en los haplotipos Cde y cdE.

El enfoque más directo para analizar el locus RHD a nivel molecular sería la amplificación por PCR abarcando el sitio de deleción de RHD. Tal ensayo no ha estado disponible, hasta la fecha, debido a que la estructura del locus RHD en individuos RhD-positivos y RhD-negativos se conocía de forma incompleta.

En consecuencia, el problema técnico subyacente a la invención era proporcionar medios y métodos para un análisis fiable, basado en ácidos nucleicos, del locus Rhesus-D. Estos medios y métodos deben ser, entre otros, adecuados para la detección y/o discriminación entre individuos RHD⁺/RHD⁺ y RHD⁺/RHD^-.

La solución a dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por tanto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico según se caracteriza en las reivindicaciones.

El gen RHD consiste en una región en 5' de RHD homóloga al clon genómico HS469D22 (número de registro de GenBank AL031284.9) bases 56.012 a 51.472; también representada por un segmento de nucleótidos denominado "fragmento de relleno" (número de registro de GenBank AB029152) bases 7.716 a 11.005; el promotor de RHD (número de registro de GenBank AJ252314) bases 1 a 1.246 (véase la figura 11) y el gen RHD definido por el ADNc de RHD (número de registro de GenBank X63097) bases 1 a 1.371 y por sus secuencias de intrones.

Según la presente descripción, el término "estructura molecular de ácido nucleico" comprende también cualquier derivado factible de la estructura de ácido nucleico a la que se hizo referencia anteriormente, con la que puede hibridarse una sonda de ácido nucleico. En otras palabras, la estructura puede prepararse mediante medios sintéticos o semisintéticos y, por tanto, consistir en o comprender un ácido nucleico peptídico. Dicho término también porta el significado de una molécula de ácido nucleico.

Según la presente invención el término "identidad" se refiere a la determinación de la identidad de secuencia usando programas de alineación adecuados, tales como BLAST.

Tal como se ha señalado anteriormente, el análisis diagnóstico de RHD-negativos a nivel molecular ha estado dificultado hasta la fecha por el hecho de que se desconocía la estructura global de los loci RHD/RHCE. Ahora se ha descubierto sorprendentemente que los dos genes, RHD y RHCE, tienen una orientación opuesta y se enfrentan entre sí con sus extremos 3'. Se ha descubierto además que el gen RHD está rodeado por dos cajas Rhesus altamente homólogas. La distancia física entre RHD y RHCE es de aproximadamente 30.000 pb y se llena con una caja Rhesus y el gen SMP1....

1. Molécula de ácido nucleico que es un gen RHD que comprende una sustitución de un único nucleótido dentro de un sitio de corte y empalme en 5' o 3', en la que dicha sustitución da lugar a una mutación dentro de una secuencia de 4 nucleótidos, una secuencia de 6 nucleótidos o una secuencia de 8 nucleótidos que comprende el sitio de corte y empalme consenso en el límite del exón 9/intrón 9 o en el límite del exón 3/intrón 3 y correlacionándose dicha molécula de ácido nucleico con un fenotipo Del.

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que dicha sustitución da lugar a una mutación RHD(K409K).

3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2, en la que dicha sustitución es una sustitución en el intrón 9 del sitio de corte y empalme en 5' de AGgt a AAgt.

4. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que dicha sustitución da lugar a una mutación RHD(G468+1)A).

5. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4, en la que dicha sustitución es una sustitución en el intrón 3 del sitio de corte y empalme en 5' de ACgt a ACat.

6. Molécula de ácido nucleico que es un gen RHD que comprende una sustitución de un único nucleótido dentro de la región codificante del gen RHD o dentro de un sitio de corte y empalme en 5' o 3', en la que dicha sustitución de nucleótido da lugar a un codón de terminación en el codón 16, a un codón de terminación en el codón 330, a una mutación de cambio de sentido en el codón 212 o a una mutación dentro de una secuencia de 4 nucleótidos, una secuencia de 6 nucleótidos o una secuencia de 8 nucleótidos que comprende el sitio de corte y empalme consenso en el límite del exón 8/intrón 8, correlacionándose dicha molécula de ácido nucleico con un fenotipo RHD-negativo.

7. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, en la que dicha sustitución da lugar a una mutación RHD(W16X).

8. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, en la que dicha sustitución es una sustitución G rightarrow A en la posición de nucleótido 48.

9. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, en la que dicha sustitución da lugar a una mutación RHD(Y330X).

10. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9, en la que dicha sustitución es una sustitución C rightarrow G en la posición de nucleótido 985.

11. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, en la que dicha sustitución da lugar a una mutación de cambio de sentido RHD(G212V).

12. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 11, en la que dicha sustitución es una sustitución G rightarrow T en la posición de nucleótido 635.

13. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, en la que dicha sustitución da lugar a una mutación RHD(G1153(+1)A).

14. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 13, en la que dicha sustitución es una sustitución en el intrón 8 del sitio de corte y empalme en 5' de AGgt a AGat.

15. Producto de proteína del gen RHD codificado por la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

16. Oligonucleótido que comprende de 12 a 50 nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con una parte de la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha parte comprende dicha mutación (de cambio de sentido) o dicho codón de terminación o la parte complementaria de los mismos.

17. Anticuerpo o aptámero o fago que se une específicamente a un producto de proteína del gen RHD según la reivindicación 15.

18. Método para someter a prueba la presencia de una molécula de ácido nucleico que codifica para un antígeno Rhesus-D mutante tal como se caracterizó mediante la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en una muestra que comprende hibridar el oligonucleótido según la reivindicación 16 en condiciones rigurosas con moléculas de ácido nucleico comprendidas en la muestra obtenida de un ser humano y detectar dicha hibridación.

19. Método según la reivindicación 18, que comprende además digerir el producto de dicha hibridación con una endonucleasa de restricción y analizar el producto de dicha digestión.

20. Método para someter a prueba la presencia de una molécula de ácido nucleico que codifica para un antígeno Rhesus-D mutante tal como se caracterizó mediante la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en una muestra que comprende determinar la secuencia de ácido nucleico de al menos una parte de la estructura molecular de ácido nucleico o molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, codificando dicha parte para dicha mutación (de cambio de sentido) o dicho codón de terminación.

21. Método según la reivindicación 20, que comprende además, antes de determinar dicha secuencia de ácido nucleico, la amplificación de al menos dicha parte de dicha estructura o molécula de ácido nucleico.

22. Método para someter a prueba la presencia de una molécula de ácido nucleico que codifica para un antígeno Rhesus-D mutante tal como se caracterizó mediante la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en una muestra que comprende llevar a cabo una reacción de amplificación usando un conjunto de cebadores que amplifica al menos una parte de dicha secuencia, en el que al menos uno de los cebadores empleados en dicha reacción de amplificación es el oligonucleótido según la reivindicación 16.

23. Método según la reivindicación 21 a 22, en el que se realiza dicha amplificación mediante o dicha reacción de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

24. Método según la reivindicación 23, en el que dicha PCR es PCR-RFLP, PCR-SSP o PCR de largo alcance.

25. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en el que se analiza el peso molecular del producto de amplificación.

26. Método para someter a prueba la presencia de una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 que codifica para alelos RHD-positivos que comprende las siguientes etapas:

en el que dichos alelos RHD-positivos se derivan de una muestra RhD-negativa serológicamente.

27. Método según la reivindicación 26, en el que se selecciona dicha muestra de una población de raza blanca.

28. Método para someter a prueba la presencia de un producto de proteína del gen RHD según la reivindicación 15 en una muestra que comprende someter a ensayo una muestra obtenida de un ser humano para determinar la unión específica al anticuerpo o aptámero o fago según la reivindicación 17.

29. Método para someter a prueba la presencia de un producto de proteína del gen RHD que codifica para la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en una muestra que comprende utilizar métodos de aglutinación directa, pruebas de antiglobulina indirecta, anticuerpos monoclonales anti-D y/o técnicas de adsorción/elución.

30. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 29, en el que dicha muestra es sangre, suero, plasma, tejido fetal, saliva, orina, tejido mucoso, moco, tejido vaginal, piel, pelo, folículo piloso u otro tejido humano.

31. Método según la reivindicación 30, que comprende el enriquecimiento de células fetales o la extracción de ADN fetal o ARNm de tejido materno, tal como sangre periférica, suero o plasma.

32. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 31, en el que se fija dicha molécula de ácido nucleico o material proteico de dicha muestra a un soporte sólido.

33. Método según la reivindicación 32, en el que dicho soporte sólido es un chip.

34. Uso de la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para el análisis de un fenotipo Rhesus-D positivo o negativo.

35. Uso de la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o el producto de proteína del gen RHD según la reivindicación 15 para la evaluación de la afinidad, avidez y/o reactividad de anticuerpos monoclonales o de antisueros policlonales, preferiblemente antisueros anti-D, antisueros anti-globulina humana o anti-globulina.

36. Uso de células, preferiblemente glóbulos rojos de probandas que portan la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la evaluación de la afinidad, avidez y/o reactividad de anticuerpos monoclonales anti-D o de anti-D policlonal o de antisueros anti-globulina humana o anti-globulina o de preparaciones de los mismos.

37. Método para la caracterización de los anticuerpos monoclonales o antisueros policlonales o de una preparación de los mismos, comprendiendo dicho método

38. Método según la reivindicación 37, en el que dicha caracterización comprende la determinación de la reactividad, sensibilidad, avidez, afinidad, especificidad y/u otras características de anticuerpos y antisueros.

39. Método según la reivindicación 37 ó 38, en el que dicha célula que porta el producto de proteína del gen RHD en su superficie es un glóbulo rojo.

40. Método para determinar si un paciente que necesita una transfusión de sangre va a transfundirse con sangre RhD-negativa de un donante que comprende la etapa de someter a prueba una muestra de dicho paciente para determinar la presencia de una o más moléculas de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que una prueba positiva para dos de dichas moléculas de ácido nucleico diferentes es indicativa de la necesidad de una transfusión con sangre Rh-negativa.

41. Método de evaluación del riesgo de que la madre RhD-negativa conciba o porte un feto RhD-positivo o del riesgo de que una madre que tiene un título anti-D conciba o porte un feto con riesgo de desarrollar enfermedad hemolítica del recién nacido que comprende evaluar una muestra obtenida del padre del feto para determinar la presencia de una o más moléculas de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

42. Preparación que comprende el anticuerpo o aptámero o fago según la reivindicación 17.

43. Método de identificación de una cadena V_H o V_L de anticuerpo o una combinación de las mismas o un aptámero que se unen específicamente a un producto de proteína del gen RHD según la reivindicación 15 que comprende

44. Método de identificación de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un producto de proteína del gen RHD según la reivindicación 15 que comprende

45. Método de identificación de una cadena V_H ó V_L de anticuerpo o una combinación de las mismas o un aptámero que se unen específicamente a un producto de proteína del gen RHD según la reivindicación 15 que comprende

46. Método de identificación de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un producto de proteína del gen RHD según la reivindicación 15 que comprende

47. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46, en el que el producto de proteína del gen RHD se expone en la superficie de una célula.

48. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 47, en el que el polipéptido o la célula huésped se fija a un soporte sólido.

49. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 48, en el que posteriormente a la etapa (b) o (c) se lleva a cabo la siguiente etapa:

50. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46, en el que, en el caso de que sólo se emplee una ronda de selección para la identificación, el número de moléculas de proteína del gen RHD de (a) está en exceso molar con respecto al número de partículas de fago.

51. Uso de células, preferiblemente glóbulos rojos que comprenden el producto de proteína del gen RHD según la reivindicación 15, a partir de probandas para la evaluación de la afinidad, avidez y/o reactividad de anti-D monoclonal según la reivindicación 17 o de anti-D policlonal o de antisueros anti-globulina humana o anti-globulina o de preparaciones de los mismos.

52. Kit que comprende