PROCEDIMIENTO PARA ESTIMAR EL NUMERO DE NUCLEOS DE UN ISOTOPO PRESELECCIONADO EN UNA ESPECIE MOLECULAR DE UN ESPECTRO DE RMN.

Un procedimiento para estimar el número de núcleos de un isótopo preseleccionado en una especie molecular de un espectro RMN de una muestra que contiene dicha especie molecular como sustancia predominante,

en el que dicho espectro RMN comprende una pluralidad de picos de señal correspondientes a dichos núcleos, en el que el procedimiento comprende las etapas de: a) seleccionar de dicha pluralidad de picos de seña un conjunto de picos de señal incluidos que cumplan un criterio de inclusión; b) ordenar dicho conjunto de picos de señal incluidos de acuerdo con un criterio de ordenación de señal preseleccionado para obtener un conjunto de picos de señal ordenados correspondiente: c) determinar la integral de cada uno de dichos picos de señal ordenados para obtener un conjunto correspondiente de integrales ordenados; d) definir un conjunto de números enteros positivos mutuamente no idénticos que no superan un número entero más elevado preseleccionado y ordenar dicho conjunto de acuerdo con un criterio de orden numérico preseleccionado para obtener un conjunto de números enteros ordenados; e) iniciar un ciclo de repetición externa seleccionando la primera de dichas integrales ordenadas para obtener una integral seleccionada; f) iniciar un ciclo de repetición interna asignando a un número consecutivo el valor del primero de dichos números enteros ordenados; g) calcular un factor de escala dado por la proporción de dicho número consecutivo a dicha integral seleccionada actualmente; h) multiplicar con dicho factor de escala cada una de dichas integrales ordenadas para producir un conjunto de integrales escaladas; i) redondear cada una de dichas integrales escaladas al valor del número entero más cercano para producir un conjunto de integrales escaladas en números enteros; j) calcular la suma de dicho conjunto de integrales escaladas en números enteros para producir un candidato a número total de núcleos; k) almacenar de forma recuperable un conjunto de resultados correspondiente al presente ciclo de repetición interna, en el que dicho conjunto de resultados almacenado contiene al menos dicho número total candidato de núcleos; l) iniciar otro ciclo de repetición interna estableciendo el número consecutivo igual al siguiente de dichos números enteros ordenados, asignando después dicho número consecutivo a dicha integral seleccionada y repitiendo las etapas g) a l) hasta que todos estos números enteros ordenados se hayan procesado; m) iniciar otro ciclo de repetición externa seleccionando el siguiente de dichas integrales ordenadas y repitiendo las etapas f) a m) hasta que se hayan procesado todas las integrales ordenadas; n) determinar de la pluralidad de dichos conjuntos de resultados almacenados el número de acontecimientos de cada uno de dichos números totales candidatos de núcleos; o) determinar el número más alto de acontecimientos; p) formar un conjunto consistente en todos los números totales candidatos de núcleos que tienen un número de acontecimientos iguales a dicho número más elevado de acontecimientos; y q) obtener un número total estimado de núcleos tomando el menor de dicho conjunto de números totales candidatos de núcleos

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para estimar el número de núcleos de un isótopo preseleccionado en una especie molecular a partir de un espectro de RMN, a un uso de dicho procedimiento y a un producto de programa informático para realizar dicho procedimiento.

Antecedentes de la invención

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear es una técnica bien conocida que se aplica ampliamente para el análisis cualitativo y cuantitativo de una gran variedad de muestras. En general, la técnica implica registrar un espectro de resonancia magnética nuclear, en lo sucesivo denominado espectro RMN, En condiciones selectivas para un isótopo nuclear preseleccionado con un momento angular de espín distinto de cero, tal como 1H, 13C o muchos otros. En general, un espectro de RMN obtenido de una muestra que contiene una especie molecular comprende una pluralidad de picos de señal resultantes de los núcleos del isótopo preseleccionado. Cada pico de señal corresponde a una frecuencia de resonancia concreta que se puede atribuir a uno o varios núcleos que experimentan un campo magnético local concreto como consecuencia del ambiente molecular concreto. De acuerdo con esto, la frecuencia de resonancia a la cual se observa un pico de señal de RMN, normalmente expresada en términos del desplazamiento químico denominado proporcionado en partes por millón (ppm) con respecto a la señal de referencia, es una indicación de la localización molecular del núcleo o núcleos que dan lugar al pico de señal.

Una importante ventaja de la espectroscopia de RMN en comparación con otras técnicas analíticas reside en el hecho de que en ciertas condiciones bien conocidas la integral de un pico de señal es directamente proporcionar al número de núcleos resonantes (véase, por ejemplo, R.R. Ernst, G. Bodenhausen y A. Wokaun, Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions, Oxford Science Publication, 1988, 91 -157). Por tanto, las integrales de los diversos picos de señal en un espectro RMN reflejan el número de núcleos que contribuyen a cada pico de señal. Este hecho se usa de forma rutinaria como guía para la interpretación manual, es decir no automática, de los espectros RMN de especies moleculares no identificadas, es decir para el análisis cualitativo.

Además, la espectroscopia RMN también puede usarse para el análisis cuantitativo.

Dada la proporcionalidad mencionada en lo que antecede entre las integrales de los picos de señal y el número de núcleos resonantes, la integral absoluta de un pico de señal de RMN está directamente relacionada con el número de moléculas que contienen los núcleos resonantes que están presentes en el volumen de detección del espectrómetro RMN. No obstante, la integral absoluta de un pico de señal de RMN dependerá, en general, de una gran cantidad de condiciones experimentales. Por tanto, el análisis cuantitativo por medio de espectroscopia RMN requiere la comparación de las integrales de señal medida con una integral derivada de una señal de calibración.

En la técnica se conocen varios procedimientos para generar una señal de calibración adecuada, tal como se ha descrito en, por ejemplo, la solicitud de patente francesa FR 2 735 865 A1. En particular, el documento 2 735 865 A1 divulga un dispositivo y un procedimiento para análisis cuantitativo mediante espectroscopia MRN que implica una señal de calibración de RMN producida por un dispositivo electrónico. Esta técnica se ha llegado a conocer con el acrónimo “ERETIC” (por “Electronic REference To access In vivo Concentrations", “Referencia electrónica para acceder a concentraciones in vivo”), tal como se describe en: L. Barantin, A. Le Pape y S. Akoka, A new method for absolute quantitation of MRS metabolites. Magn. Res. Methods Vol. 38 (1997) 179-182.

Un problema fundamental en las aplicaciones cualitativas y cuantitativas de la espectroscopia RMN se debe al hecho de que cualquier espectro RMN obtenido en la práctica se desviará en algún grado de la expectativa teórica. Esta discrepancia se debe, principalmente, a las inevitables contribuciones del ruido, y también a otras influencias experimentales tales como falta de homogeneidades de campo, desviaciones y otros efectos. Además, los efectos del disolvente y las reacciones de intercambio, por ejemplo intercambio de iones de hidrógeno cuando se realiza una espectroscopia RMN-1H puede conducir a inexactitudes en la determinación de las integrales. Como consecuencia, la integral de un pico de señal en comparación con otras de la misma especie molecular diferirá, en general, algo con respecto a la expectativa teórica. Otro problema se debe a la denominada degeneración del desplazamiento químico, que se refiere a una situación en la que los núcleos en diferentes localizaciones dentro de una especie molecular tienen desplazamientos químicos esencialmente idénticos y, por tanto, dan lugar al solapamiento de los picos de señal RMN. Estos hechos dan lugar a las siguientes dificultades en el análisis cualitativo y cuantitativo mediante espectroscopia RMN.

En el análisis cualitativo, se deben reescalar las integrales relativas de todos los picos de señal en un espectro RMN concreto de una especie molecular, es decir la integral de cada pico de señal se deberá multiplicar por un factor de escala común de modo que cada una de las integrales reescaladas sea un número entero. El factor de escala común representa la sensibilidad de detección del aparato y la concentración de dicha especie molecular en la muestra. El conjunto de números enteros obtenidos de este modo corresponde al número de núcleos en la especie molecular que da lugar a los diversos picos de señal. En los casos favorables de espectros sencillos no congestionados con ruidos pequeños, este procedimiento se lleva a cabo con éxito de un modo directo. No obstante, en condiciones menos favorables, el cálculo de un conjunto de intensidades reescaladas enteras puede dar como resultado una solución con números de núcleos no realistas. Por ejemplo, dos picos de señal, cada uno resultante de un núcleo específico en una molécula, deberá tener la misma integral de señal, pero encontrar una proporción integral experimental de 0,97/1,03 sugeriría que la especie molecular tiene 97 núcleos de la primera clase y 103 núcleos de la segunda clase y, por tanto, conduciría a una interpretación inaceptable del espectro RMN.

En el análisis cuantitativo, la integral de un pico de señal RMN específico de la especie molecular que se quiere determinar se compara con la integral de un pico de calibración adecuado, que, por ejemplo, puede ser una señal RMN sintética de acuerdo con el procedimiento ERETIC o puede derivar de una sustancia de calibración de la concentración conocida añadida a la muestra. Obviamente, esta comparación debe tener en cuenta debidamente el número de núcleos con desplazamiento químico idéntico que contribuye al pico de señal específico. Como en el caso del análisis cualitativo, cualquier desviación causada experimentalmente con respecto a la integral de señal ideal tendría como resultado un error correspondiente de la estimación cuantitativa. En el sencillo ejemplo mencionado en lo que antecede, dependiendo de si la primera o la segunda integral se compara con la integral de calibración, el resultado sería 0,97 o 1,03 veces el resultado verdadero.

En resumen, la utilidad de la espectroscopia RMN en análisis cualitativos y cuantitativos está limitada por el hecho de que debido a las inevitables inexactitudes experimentales y debido a la degeneración del desplazamiento químico, el número de núcleos de un isótopo preseleccionado en una especie molecular, en general, no está directamente disponible con un espectro RMN de una muestra que contiene dicha especie molecular. La aplicación de espectroscopia RMN en los campos mencionados en lo que antecede también se ha visto dificultada por el hecho de que en la técnica no se conoce una determinación automática de la concentración y la pureza de las muestras. El análisis automático de las muestras con respecto al número de núcleos es un requisito previo si se requiere el análisis cuantitativo y cualitativo basado en RMN con un alto rendimiento.

Resumen de la invención

Es el objeto principal de la presente invención para superar las dificultades mencionadas en lo que antecede y las limitaciones de la espectroscopia RMN para análisis cualitativo y cuantitativo.

Es otro objeto de la presente...

1. Un procedimiento para estimar el número de núcleos de un isótopo preseleccionado en una especie molecular de un espectro RMN de una muestra que contiene dicha especie molecular como sustancia predominante, en el que dicho espectro RMN comprende una pluralidad de picos de señal correspondientes a dichos núcleos, en el que el procedimiento comprende las etapas de: a) seleccionar de dicha pluralidad de picos de seña un conjunto de picos de señal incluidos que cumplan un criterio de inclusión; b) ordenar dicho conjunto de picos de señal incluidos de acuerdo con un criterio de ordenación de señal preseleccionado para obtener un conjunto de picos de señal ordenados correspondiente: c) determinar la integral de cada uno de dichos picos de señal ordenados para obtener un conjunto correspondiente de integrales ordenados; d) definir un conjunto de números enteros positivos mutuamente no idénticos que no superan un número entero más elevado preseleccionado y ordenar dicho conjunto de acuerdo con un criterio de orden numérico preseleccionado para obtener un conjunto de números enteros ordenados; e) iniciar un ciclo de repetición externa seleccionando la primera de dichas integrales ordenadas para obtener una integral seleccionada; f) iniciar un ciclo de repetición interna asignando a un número consecutivo el valor del primero de dichos números enteros ordenados; g) calcular un factor de escala dado por la proporción de dicho número consecutivo a dicha integral seleccionada actualmente; h) multiplicar con dicho factor de escala cada una de dichas integrales ordenadas para producir un conjunto de integrales escaladas; i) redondear cada una de dichas integrales escaladas al valor del número entero más cercano para producir un conjunto de integrales escaladas en números enteros; j) calcular la suma de dicho conjunto de integrales escaladas en números enteros para producir un candidato a número total de núcleos;

k) almacenar de forma recuperable un conjunto de resultados correspondiente al presente ciclo de repetición interna, en el que dicho conjunto de resultados almacenado contiene al menos dicho número total candidato de núcleos;

l) iniciar otro ciclo de repetición interna estableciendo el número consecutivo igual al siguiente de dichos números enteros ordenados, asignando después dicho número consecutivo a dicha integral seleccionada y repitiendo las etapas g) a l) hasta que todos estos números enteros ordenados se hayan procesado;

m) iniciar otro ciclo de repetición externa seleccionando el siguiente de dichas integrales ordenadas y repitiendo las etapas f) a m) hasta que se hayan procesado todas las integrales ordenadas;

n) determinar de la pluralidad de dichos conjuntos de resultados almacenados el número de acontecimientos de cada uno de dichos números totales candidatos de núcleos;

o) determinar el número más alto de acontecimientos;

p) formar un conjunto consistente en todos los números totales candidatos de núcleos que tienen un número de acontecimientos iguales a dicho número más elevado de acontecimientos; y

q) obtener un número total estimado de núcleos tomando el menor de dicho conjunto de números totales candidatos de núcleos.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además las etapas de: a) comprobar si dicho número total de núcleos estimado o cualquier número entero múltiplo del mismo hasta un número entero más grande preseleccionado es idéntico a un número total de núcleos nominal de dicha especie molecular; y

b) si todas estas comprobaciones de identidad son negativas, emitiendo una notificación de advertencia.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que cada uno de dichos conjuntos de resultados almacenados comprende además una medida global de desviación entre la pluralidad de las integrales escaladas en números enteros y la pluralidad de las integrales escaladas obtenidas en el presente ciclo de repetición interna, en el que el procedimiento comprende además las etapas de:

a) tomar todos los conjuntos de resultados que corresponden a dicho número total de núcleos estimado; b) seleccionar el conjunto de resultados que tiene la medida global de desviación

más pequeña; y

c) asignar a cada uno de los picos de señal ordenados un correspondiente número parcial de núcleos obtenido tomado, de dicho conjunto de resultados seleccionado, la integral escalada en número entero correspondiente a dicho pico de señal ordenado.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además las etapas de:

a) proporcionar un pico de señal de calibración que no cumple dicho criterio de inclusión y que corresponde a un número especificado de núcleos de una especie de calibración;

b) integrar dicho pico de señal de calibración y dividir el resultado por dicho número especificado de núcleos para obtener una integral de calibración; c) seleccionar dicho pico de señal de calibración y dividir el resultado por dicho número especificado de núcleos para obtener una integral de calibración; d) tomar la sumar de las integrales ordenadas correspondiente a los picos de

señal ordenados de dicho conjunto de cuantificación;

e) tomar la suma de los números de núcleos parciales estimados de los picos de señal ordenados de dicho conjunto de cuantificación;

f) obtener una integral de la muestra normalizada definida como la proporción entre dicha suma de integrales ordenadas y dicha suma de números de núcleos parciales; y

g) dividir dicha integral de la muestra normalizada por dicha integral de calibración para obtener una concentración relativa de la especie molecular en la muestra.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho conjunto de cuantificación consta del pico de señal ordenado correspondiente a la integral seleccionada asociada con el conjunto de resultados seleccionado.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, en el que dicho pico de señal de calibración se genera por medio de un procedimiento ERETIC.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, que comprende además la etapa de obtener, del conjunto de picos de señal ordenados y los correspondientes números parciales estimados de núcleos, un conjunto de sustancias relacionado con dicha especie molecular y un conjunto de impurezas relacionado con la especie de impureza contenida en dicha muestra, en el que el conjunto de sustancias comprende los picos de señal ordenados cuyo número parcial estimado de núcleos es mayor que cero y el conjunto de impurezas comprende los picos de señal ordenados 5 cuyo número parcial estimado de núcleos es igual a cero. 8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende además las etapas de: a) obtener una integral relacionada con la sustancia tomando una integral o la suma de una pluralidad de integrales correspondiente a los picos de señal de dicho conjunto 10 de sustancias: b) obtener una impureza relacionada con la sustancia tomando una integral o la suma de una pluralidad de integrales correspondiente a los picos de señal de dicho conjunto de impurezas; y c) comparar la integral relacionada con la impureza y la integral relacionada con la 15 sustancia para obtener una medida del número relativo de núcleos de especies de impureza contenidas en la muestra. 9. Uso del procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para la determinación cuantitativa de dicha especie molecular en dicha muestra. 20 10. Un producto de programa informático que comprende medios de codificación del programa almacenados en un medio legible por ordenador para realizar el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 cuando el producto del programa informático es ejecutado en un sistema de ordenador. 25