Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima que tiene actividad endo-ß-1,

4-glucanasa y actividad óptima a una temperatura de al menos 90ºC, preferiblemente al menos 95ºC, más preferiblemente al menos 100ºC, la secuencia de ADN comprende

a) la secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la endo-ß-1,4-glucanasa de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11203, o

b) un análogo de la secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la endo-ß-1,4-glucanasa de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11203, que

i) es al menos idéntica en un 80%, con la secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la endo-ß-1,4-glucanasa de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11203, o

ii) codifica un polipéptido que es al menos idéntico en un 50%, con el polipéptido de SEC ID NO:2 o el polipéptido codificado por una secuencia de ADN que comprende la secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la endo-ß-1,4-glucanasa de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11203

Endo-beta-1,4-glucanasa termoestable.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una enzima con actividad celulolítica a alta temperatura, especialmente una endo-beta-1,4-glucanasa; una secuencia de ADN clonada codificando la enzima con actividad celulolítica; un método para proporcionar un gen que codifica tal enzima; un método para producir la enzima; una composición enzimática que comprende la enzima con actividad celulolítica; y el uso de dicha enzima y composición enzimática para varias aplicaciones industriales.

Antecedentes de la invención

Celulasas o enzimas celulolíticas son enzimas implicadas en hidrólisis de celulosa. En la hidrólisis de celulosa nativa, es conocido que hay tres tipos más importantes de enzimas de celulasa implicadas, a saber celobiohidrolasa (1,4-beta-D-glucano celobiohidrolasa, EC 3,2,1,91), endo-beta-1,4-glucanasa (endo-1,4-beta-D-glucano 4-glucanohidrolasa, EC 3,2,1,4) y beta-glucosidasa (EC 3,2,1,21).

Especialmente las endo-beta-1,4-glucanasas (EC nº. 3,2,1,4) constituyen un grupo interesante de hidrolasas para los usos industriales mencionados. Endo-beta-1,4-glucanasas catalizan la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glicosídícos en celulosa, derivados de celulosa (tal como carboxi metil celulosa e hidroxi etil celulosa), liquenina, enlaces beta-1,4 en glucanos beta-1,3 mezclados tales como beta-D-glucanos de cereal o xiloglucanos y otro material vegetal que contiene partes celulósicas. El nombre autorizado es endo-1,4-beta-D-glucan 4-glucano hidrolasa, pero el término abreviado endo-beta-1,4-glucanasa se usa en la presente descripción. Cabe hacer referencia a T.-M. Enveri, "Microbial Cellulases" en W.M. Fogarty, Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science Publishers, p. 183-224 (1983); Methods in Enzymology, (1988) Vol. 160, p. 200-391 (editado por Wood, W.A. and Kellogg, S.T.); Béguin, P., "Molecular Biology of Cellulose Degradation", Annu. Rev. Microbiol. (1990), Vol. 44, pp. 219-248; Béguin, P. and Aubert, J-P., "The biological degradation of cellulose", FEMS Microbiology Reviews 13 (1994) p.25-58; Henrissat, B., "Cellulases and their interaction with cellulose", Cellulose (1994), Vol. 1, pp. 169-196.

Las celulasas se sintetizan por un gran número de microorganismos que incluyen hongos, actinomicetos, mixobacterias y bacterias reales pero también por plantas. Especialmente endo-beta-1,4-glucanasas de una amplia variedad de especificidades han sido identificadas. Muchas endo-beta-1,4-glucanasas bacterianas han sido descritas (Henrissat, B. and Bairoch, A. (1993) Biochem J. 293:781-788; Gilbert, H.J. and Hazlewood, G.P. (1993) J. Gen. Microbiol. 139:187-194).

El grupo taxonómico Archaea superior se divide en dos divisiones Euryarchaeota y Crenarchaeota. El grupo Thermococcales en la división Euryarchaeota de Archaea comprende los géneros Pyrococcus y Thermococcus (Maidak et al. (1996)). Estos organismos se aislan de situaciones sulfatáricas marinas o terrestres, y son hipertermófilos anaeróbicos. Pyrococcus furiosus muestra crecimiento óptimo a 100ºC, y la temperatura máxima de crecimiento está a 103ºC. El crecimiento óptimo se obtiene en presencia de 15-35 g/l de NaCl. Como fuentes de carbono P. furiosus se describe para utilizar péptidos, proteínas, almidón al igual que maltosa (Zillig (1992)).

Diferentes enzimas extracelulares han sido descritas de especies de Archaeon. Por ejemplo, de P. furiosus, DSM 3638, una amilasa con temperatura óptima a aprox. 100ºC ha sido clonada y expresada en E. coli y B. subtilis (solicitud de patente Internacional PCT/DK/90/00074). También otras enzimas hidrolíticas tales como xilanasas extracelulares, beta-manosidasas y beta-galactosidasas y una proteasa intracelular ha sido descrita de diferentes especies de Archaeon (Halio et al. (1996)).

Una beta-glucosidasa ha sido descrita, caracterizada y clonada de Pyrococcus furiosus, DSM 3638, (Kengen (1993)). La caracterización de beta-glucosidasa de P. furiosus reveló que esta enzima no tiene actividad en celulosa u otros polímeros de la glucosa beta-enlazados (Bauer et al. (1996)). En WO 97/44361 (página 115-117) está descrita una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad endo-beta-1,4-glucanasa que se deriva de Pyrococcus furiosus. Thermophilum pendens, una especie relacionada con Pyrobaculum en la división de Crenarchaeota de Archaea ha sido mostrada para producir cantidades pequeñas de una glucanasa con actividad contra carboximetilcelulosa a 88ºC. No obstante, ninguna otra caracterización de ninguna enzima o aislados está descrita (Bragger et al. (1989)).

La actividad xiloglucanasa no está incluida en la clasificación de enzimas proporcionada por la Nomenclatura Enzimática (1992). Hasta ahora, esta actividad enzimática ha sido clasificada simplemente como actividad de glucanasa y ha sido frecuentemente considerada idéntica a la actividad celulolítica (EC 3,2,1,4), es decir actividad contra enlaces ß-1,4-glicosídicos en celulosa o sustratos derivados de celulosa, o al menos como una actividad secundaria en enzimas que tienen actividad celulolítica. No obstante, una xiloglucanasa real es una enzima específica para xiloglucano real capaz de catalizar la solubilización de xiloglucano para oligosacáridos de xiloglucano pero que no presentan actividad sustancial celulolítica, p. ej. actividad contra los sustratos usados de forma convencional tipo celulosa CMC (carboximetilcelulosa), celulosa HE y Avicel (celulosa microcristalina). Una xiloglucanasa corta los enlaces beta-1,4-glicosídicos en el esqueleto de xiloglucano.

La atividad de xiloglucanasa es descrita por Vincken et al. (1997) que caracteriza tres diferentes endo-beta-1,4-glucanasas de Trichoderma viride (similar a T. reesei) que tienen todas alta actividad contra celulosa o CMC y muestran que la EndoI (perteneciente a la familia 5 de glicosil hidrolasas, véase Henrissat, B. et al. (1991, 1993)) no tiene esencialmente (es decir, muy poca) actividad contra xiloglucano, y que EndoV (perteneciente a la familia 7 de glicosil hidrolasas) y EndoIV (perteneciente a la familia 12 de glicosil hidrolasas) ambas tienen actividad contra xiloglucano y CMC, respectivamente, del mismo orden de magnitud. Por consiguiente, es conocido que la familia 12 de endo-beta-1,4-glucanasas puede también presentar actividad xiloglucanasa.

Un uso industrial muy importante de enzimas celulolíticas es el uso para tratamiento de fibras celulósicas, textil o tejido, p. ej. como ingredientes en composiciones de detergente o composiciones de suavizante, para lavado enzimático de material celulósico para la industria textil, para desencolado de tejidos tejidos, para biopulido de tejidos nuevos (acabado de prendas de vestir), y para obtener un aspecto "lavado a la piedra" de tejidos conteniendo celulosa, especialmente tela vaquera, y diferentes métodos para este tipo de tratamiento han sido sugeridos, p. ej. en GB-A-1 368 599, EP-A-0 307 564 y EP-A-0 435 876, WO 91/17243, WO 91/10732, WO 91/17244, PCT/DK95/000108 y PCT/DK95/00132. Otro uso industrial importante de enzimas celuliticas es el uso para tratamiento de pasta de papel, p. ej. para mejorar el drenaje o para desentintar el papel reciclado.

Es también conocido que las celulasas pueden o pueden no tener un dominio de enlace de celulosa (un CBD). El CBD mejora la unión de la enzima a una fibra conteniendo celulosa y aumenta la eficacia de la parte catalítica activa de la enzima.

Siempre existe una necesidad de suministrar preparaciones enzimáticas de celulasa nuevas que se pueden usar para aplicaciones donde es deseable una actividad celulasa, preferiblemente una actividad endo-beta-1,4-glucanasa.

El objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones enzimáticas nuevas con actividad celulítica sustancial a condiciones de alta temperatura y un rendimiento mejorado en el procesamiento de la pasta de papel, tratamiento textil, procesos de lavandería, procesos de extracción o en pienso; preferiblemente celulasas nuevas, más preferiblemente endo beta-1,4- glucanasas de buen funcionamiento, contempladas para ser producibles o producidas por técnicas recombinantes.

Resumen de la invención

Los inventores han tenido éxito ahora en la clonación y caracterización de una secuencia de ADN de especies arquéales de Pyrococcus furiosus que codifica una actividad celulolítica que presenta actividad enzimática a temperatura extremadamente alta en un margen de pH muy amplio,...

1. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima que tiene actividad endo-ß-1,4-glucanasa y actividad óptima a una temperatura de al menos 90ºC, preferiblemente al menos 95ºC, más preferiblemente al menos 100ºC, la secuencia de ADN comprende

a) la secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la endo-ß-1,4-glucanasa de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11203, o

b) un análogo de la secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la endo-ß-1,4-glucanasa de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11203, que

i) es al menos idéntica en un 80%, con la secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la endo-ß-1,4-glucanasa de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11203, o

ii) codifica un polipéptido que es al menos idéntico en un 50%, con el polipéptido de SEC ID NO:2 o el polipéptido codificado por una secuencia de ADN que comprende la secuencia de ADN correspondiente a la parte codificante de la endo-ß-1,4-glucanasa de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11203.

2. El constructo de ADN según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ADN se aisla de o es producida basándose en una biblioteca de ADN de una cepa del género Pyrococcus, incluso más preferiblemente de la especie Pyrococcus furiosus, especialmente Pyrococcus furiosus, DSM 3638.

3. Constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la secuencia de ADN se aisla de Escherichia coli, DSM 11203.

4. Constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que además comprende una secuencia de ADN que codifica un dominio de unión a celulosa (CBD).

5. El constructo de ADN según la reivindicación 4 que además comprende una secuencia de ADN que codifica el dominio de unión a la celulosa (CBD), el dominio de unión a la celulosa y el núcleo enzimático (dominio catalíticamente activo) de la enzima codificada por la secuencia de ADN del constructo de ADN que está enlazada operablemente.

6. Vector de expresión recombinante que comprende un constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Célula huésped en la que un constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o un vector de expresión recombinante según la reivindicación 6 ha sido introducido.

8. Célula según la reivindicación 7, que es una célula procariótica, en particular una célula bacteriana; o una célula eucariótica, en particular una célula micótica filamentosa; o una célula endógena a partir de la cual se origina la secuencia de ADN, que codifica una muestra enzimática que presenta actividad endo-ß-1,4-glucanasa.

9. Célula según la reivindicación 8, donde la célula bacteriana pertenece a una cepa de Bacillus, preferiblemente una cepa de Bacillus subtilis o Bacillus lentus; y la célula fúngica pertenece a una cepa seleccionada de Aspergillus ssp. y Fusarium ssp.

10. Célula según la reivindicación 7 u 8, donde la célula pertenece a una cepa de Pyrococcus, preferiblemente Pyrococcus furiosus, DSM 3638.

11. Célula según la reivindicación 7 u 8, donde la célula pertenece a una cepa de Saccharomyces, preferiblemente una cepa de Saccharomyces cerevisiae.

12. Método para producir una enzima que tiene actividad endo-ß-1,4-glucanasa y actividad óptima por encima de 90ºC, preferiblemente por encima de 95ºC, más preferiblemente por encima de 100ºC, el método comprendiendo el cultivo de una célula según cualquiera de las reivindicaciones 7-11 bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y recuperación de la enzima del cultivo.

13. Método según la reivindicación 12, donde la enzima recuperada tiene al menos un 20% de pureza.

14. Enzima aislada que tiene actividad endo-ß-1,4-glucanasa, en la que la enzima está (i) libre de impurezas homologas, y (ii) producida por el método según la reivindicación 12 o 13.

15. Enzima con actividad endo-ß-1,4-glucanasa y actividad óptima por encima de 90ºC, preferiblemente por encima de 95ºC, más preferiblemente por encima de 100ºC, la enzima

a) es codificada por un constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o

b) es al menos un 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO:2, o

c) es producida por el método según la reivindicación 13, o

d) es un polipéptido producido por Pyrococcus furiosus, DSM 3638, que es codificable por la endo-ß-1,4-glucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11203.

16. Enzima según la reivindicación 14 o 15, que pertenece a la familia 12 de glicosil hidrolasas.

17. Preparación enzimática que es enriquecida con la enzima según cualquiera de las reivindicaciones 14-16.

18. Preparación según la reivindicación 17, que adicionalmente comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en mananasas, galactanasas, xilanasas, arabinanasas, pectina acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, pectina liasas, pectato liasas, pectina metil-esterasas, endo-ß-1,4-glucanasas, proteasas, lipasas, amilasas, cutinasas, peroxidasas, lacasas, celobiohidrolasas y transglutaminasas.

19. Cultivo biológico aislado sustancialmente puro de la cepa de Escherichia coli, DSM 11203.

20. Uso de la enzima según cualquiera de las reivindicaciones 14-16 o la preparación enzimática según las reivindicaciones 17 o 18 en la industria textil para mejorar las propiedades de las fibras celulósicas o tejido o para proporcionar un aspecto de lavado a la piedra de la tela vaquera; o en la industria del procesamiento de fibras celulósicas; o en procesos de limpieza industrial; o material polimérico extruido por calor; o en la conversión de biomasa en azúcares; o en la producción de alcohol; o para predigestión de p. ej. granos usados en la producción de pienso; o en la producción de café instáneo o procesos de extracción similares; o en la industria petrolera para la degradación de soluciones acuosas de derivados de celulosa del hidrocoloide usados en perforación o en recuperación del petróleo mejorada por inundación polimérica.