ELECTRODO PARA BIOSENSOR.
Una tira de electrodos desechable de un solo uso para la unión al circuito de lectura de señales de un sistema sensor para detectar una corriente representativa de un analito en una muestra acuosa,
comprendiendo la tira: a) un soporte alargado (1) que tiene una superficie plana, lisa, adaptada para la unión liberable a dicho circuito de lectura; b) un primer conductor (4) que se extiende a lo largo de dicha superficie y que comprende un elemento conductor para la conexión con dicho circuito de lectura; c) un electrodo activo (5) sobre dicha superficie en contacto con dicho primer conductor, comprendiendo dicho electrodo activo un compuesto mediador que tiene una de las dos siguientes fórmulas: en las que X e Y pueden ser independientemente oxígeno, azufre, CR 3 R 4 , NR 3 o NR 3 R 4+ o el grupo funcional CZ 1 Z 2 , en el que Z 1 y Z 2 son grupos atractores de electrones; R1 y R2 pueden ser independientemente un grupo aromático o heteroaromático sustituido o no sustituido; y R 3 y R 4 pueden ser independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo alquilo, arilo, heteroarilo, amino, alcoxilo o ariloxilo sustituido o no sustituido; d) un segundo conductor (3) que se extiende a lo largo de dicha superficie, que comprende un elemento conductor para la conexión con dicho circuito de lectura; e) un electrodo de referencia/auxiliar (6) en contacto con dicho segundo conductor; f) un tercer conductor (2) que se extiende a lo largo de dicha superficie, que comprende un elemento conductor para la conexión con dicho circuito de lectura y un electrodo indicador de relleno (7) en contacto con dicho tercer conductor; g) estando dichos conductores espaciados de modo que no están en contacto eléctrico, y estando configurados de modo que no se ponen en contacto eléctrico cuando dicha muestra acuosa se pone sobre dicha tira; h) estando configurados dicho electrodo activo y dicho electrodo de referencia/auxiliar de modo que pueden cubrirse simultáneamente por una pequeña gota de dicha muestra acuosa para proporcionar un camino de conducción eléctrica entre dichos electrodos
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07105224.
Solicitante: ABBOTT LABORATORIES.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: D-377/AP6A-1 100 ABBOTT PARK ROAD ABBOTT PARK, ILLINOIS 60064-60 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: WATKIN, JARED, L., FORROW,NIGEL,J, SANGHERA,GURDIAL,S, WALTERS,STEPHEN.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 16 de Octubre de 1998.
Fecha Concesión Europea: 1 de Septiembre de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/00B4
- C12Q1/00B6
- C12Q1/00B6B
Clasificación PCT:
- C12Q1/00 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones.
- G01N27/30 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 27/00 Investigación o análisis de materiales mediante el empleo de medios eléctricos, electroquímicos o magnéticos (G01N 3/00 - G01N 25/00 tienen prioridad; medida o ensayo de variables eléctricas o magnéticas o de las propiedades eléctricas o magnéticas de los materiales G01R). › Electrodos, p. ej. electrodos para el análisis; Semicélulas (G01N 27/414 tiene prioridad).
- G01N27/327 G01N 27/00 […] › Electrodos bioquímicos.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, España, Francia, Reino Unido, Italia, Liechtensein, Países Bajos.
![ELECTRODO PARA BIOSENSOR.](https://patentados.com/img/2010/12/electrodo-para-biosensor.jpg)
Fragmento de la descripción:
Antecedentes de la invención
La invención está en el campo general de los electrodos para biosensores amperométricos. Más específicamente, la invención está en el campo de compuestos para usar como mediadores para el reciclaje de cofactores usados en estos electrodos.
Las enzimas dependientes de NAD y NADP tienen un gran interés en cuanto que muchas tienen sustratos de valor clínico, tales como la glucosa, D-3hidroxibutirato, lactato, etanol y colesterol. Se pueden diseñar electrodos amperométricos para detectar estos sustratos y otros analitos incorporando esta clase de enzimas y estableciendo comunicación eléctrica con el electrodo a través de la oxidación mediada de los cofactores reducidos NADH y NADPH.
Las enzimas dependientes de NAD y NADP en general son oxidorreductasas intracelulares (EC 1.x.x.x). Las oxidorreductasas se clasifican además de acuerdo con la identidad del grupo donador de un sustrato sobre el que actúan. Por ejemplo, las oxidorreductasas que actúan en un grupo CH-OH en un sustrato se clasifican como EC 1.1.x.x, mientras que aquellas que actúan en un grupo aldehído o ceto de un sustrato se clasifican como EC 1.2.x.x. Algunos analitos importantes (p. ej., glucosa, D-3-hidroxibutirato, lactato, etanol y colesterol) son sustratos de las enzimas EC
1.1.x.x.
La categoría de las oxidorreductasas también se divide de acuerdo con el tipo de aceptor usado por la enzima. Las enzimas de relevancia de la presente invención tienen al NAD+ y NADP+ como aceptores y se clasifican como EC.1.x.1.x. Estas enzimas en general tienen grupos sulfidrilo en sus sitios activos y por lo tanto pueden ser inhibidas de forma irreversible por reaccionantes reactivos con tiol, tales como el yodoacetato. Un inhibidor irreversible forma un compuesto estable, a menudo por la formación de un enlace covalente con un resto de aminoácido particular (p. ej., cisteína o Cys) que es esencial para la actividad enzimática. Por ejemplo, la gliceraldehído-3-P deshidrogenasa (EC 1.2.1.9) es alquilada estequiométricamente por el yodoacetato en la Cys1.19 con pérdida simultánea de la actividad catalítica. Además, se sabe que las enzimas glucosa deshidrogenasa, D-3-hidroxibutirato deshidrogenasa (HBDH) y lactato deshidrogenasa son inhibidas de forma irreversible por los reaccionantes de tipo tiol.
Las tiras de electrodos para usar en un sensor electroquímico se describen en el documento US 5628890. Dichas tiras de electrodos se caracterizan por un soporte de electrodos, un electrodo de referencia o auxiliar dispuesto en el soporte, un
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electrodo de trabajo separado del electrodo de referencia o auxiliar en el soporte, una capa de recubrimiento, y una pluralidad de capas de malla interpuestas en el espacio encerrado entre la capa de recubrimiento y el soporte. El electrodo de trabajo incluye una enzima capaz de catalizar una reacción que implica un sustrato para la enzima o un sustrato para dicha enzima y un mediador capaz de transferir electrodos.
Por lo tanto, en la búsqueda del desarrollo de biosensores estables que contengan deshidrogenasas dependientes de NAD o NADP, es muy importante evitar compuestos que sean reactivos frente a tioles, ya que pueden actúar como inhibidores de enzimas.
Sumario de la invención
La presente invención se basa en el descubrimiento de compuestos mediadores de NAD+ y NADP+ que no se unen de forma irreversible a grupos tiol de los sitios activos de las enzimas deshidrogenasa intracelulares. Dichos compuestos mediadores impiden un modo común de inhibición enzimática. Por lo tanto, los mediadores pueden aumentar la estabilidad y fiabilidad de la respuesta eléctrica en electrodos amperométricos construidos a partir de enzimas dependientes de NAD o NADP.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una tira de electrodos desechable de un solo uso como se especifica en la reivindicación 1.
Cualquier grupo alquilo, salvo que se especifique lo contrario, puede ser lineal
Un grupo arilo aromático puede ser cualquier hidrocarburo aromático y puede contener de 6 a 24, preferiblemente de 6 a 18, más preferiblemente de 6 a 16 y en especial de 6 a 14 átomos de carbono. Los grupos arilo preferidos incluyen fenilo, naftilo, antrilo, fenantrilo y pirilo, en especial un grupo fenilo o naftilo, y en particular un grupo fenilo. Cuando un resto arilo forma parte de otro grupo, por ejemplo, el resto arilo de un grupo ariloxilo, se prefiere que sea un resto fenilo, naftilo, antrilo, fenantrilo Un grupo heteroaromático o heteroarilo puede ser cualquier sistema anular monocíclico o policíclico aromático, que contiene al menos un heteroátomo. Preferiblemente, un grupo heteroarilo es un sistema anular aromático de 5 a 18 - 3 miembros, en particular de 5 a 14 miembros, y en especial de 5 a 10 miembros, que contiene al menos un heteroátomo seleccionado de átomos de oxígeno, azufre y nitrógeno. Se prefieren en particular los grupos heteroarilo de 5 y 6 miembros, en especial los grupos de 6 miembros. Se prefieren en especial los grupos heteroarilo que contienen al menos un átomo de nitrógeno. Los grupos heteroarilo preferidos incluyen grupos piridilo, pirilio, tiopirilio, pirrolilo, furilo, tienilo, indolinilo, isoindolinilo, indolizinilo, imidazolilo, piridonilo, pironilo, pirimidinilo, pirazinilo, oxazolilo, tiazolilo, purinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinoxalinilo, piridazinilo, benzofuranilo, benzoxazolilo y acridinilo. Cuando cualquiera de los sustituyentes anteriores se especifica como sustituido, los grupos sustituyentes que pueden estar presentes pueden ser uno cualquiera o más de los usados habitualmente en el desarrollo de compuestos para usar en reacciones electroquímicas y/o en la modificación de dichos compuestos para influir en su estructura/actividad, solubilidad, estabilidad, capacidad mediadora, potencial normal (Eº) u otra propiedad. Los ejemplos específicos de dichos sustituyentes incluyen, por ejemplo, átomos de halógeno, grupos oxo, nitro, ciano, hidroxilo, cicloalquilo, alquilo, halogenoalquilo, alcoxi, halogenoalcoxi, amino, alquilamino, dialquilamino, formilo, alcoxicarbonilo, carboxilo, alcanoilo, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfinilo, arilsulfonilo, carbamoilo, alquilamido, arilo o ariloxi. Cuando cualquiera de los sustituyentes anteriores representa o contiene un grupo sustituyente alquilo, este puede ser lineal o ramificado y puede contener hasta 12, preferiblemente hasta 6 y en especial hasta 4 átomos de carbono. Un grupo cicloalquilo puede contener de 3 a 8, preferiblemente de 3 a 6 átomos de carbono. Un grupo o resto arilo puede contener de 6 a 10 átomos de carbono, prefiriéndose en especial grupos fenilo. Un átomo de halógeno puede ser un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo y cualquier grupo que contenga un resto halógeno, tal como un grupo halogenoalquilo, puede así contener uno cualquiera o más de estos átomos de halógeno. Un grupo atractor de electrones puede ser cualquier grupo que forme un grupo metileno estable CZ1Z2. Dichos grupos atractores de electrones pueden incluir átomos de halógeno, grupos nitro, ciano, formilo, alcanoilo, carboxilo y ácido sulfónico. Preferiblemente, X e Y son ambos átomos de oxígeno. También se prefiere que R1 y R2 se seleccionen independientemente de grupos fenilo, naftilo, piridilo y pirrolilo, prefiriéndose en especial grupos piridilo. La expresión “grupo piridilo” también incluye el N-óxido del mismo así como grupos piridinio y - 4 piridinio N-sustituidos. Preferiblemente, R1 y R2 no están sustituidos o están sustituidos solo con uno o más, preferiblemente 1 ó 2 grupos alquilo, en especial grupos metilo. Se prefiere en especial que R1 y R2 no estén sustituidos. R3 y R4, si están presentes, se seleccionan preferiblemente de átomos de hidrógeno y grupos alquilo. Los complejos y quelatos de metales incluyen complejos y quelatos con metales de transición, en especial... o ramificado y puede contener hasta 12, preferiblemente hasta 6 y en especial hasta 4 átomos de carbono. Los grupo alquilo preferidos son metilo, etilo, propilo y butilo. Cuando un resto alquilo forma parte de otro grupo, por ejemplo el resto alquilo de un grupo alcoxilo, se prefiere que contenga hasta 6, en especial hasta 4 átomos de carbono. Los restos alquilo preferidos son metilo y etilo.
Reivindicaciones:
1. Una tira de electrodos desechable de un solo uso para la unión al circuito de lectura de señales de un sistema sensor para detectar una corriente representativa de 5 un analito en una muestra acuosa, comprendiendo la tira: a) un soporte alargado (1) que tiene una superficie plana, lisa, adaptada para la unión liberable a dicho circuito de lectura; b) un primer conductor (4) que se extiende a lo largo de dicha superficie y que comprende un elemento conductor para la conexión con dicho circuito de lectura; c) un electrodo activo (5) sobre dicha superficie en contacto con dicho primer conductor, comprendiendo dicho electrodo activo un compuesto mediador que tiene una de las dos siguientes fórmulas:
**(Ver fórmula)**
en las que X e Y pueden ser independientemente oxígeno, azufre, CR3R4, NR3 o NR3R4+ o el grupo funcional CZ1Z2, en el que Z1 y Z2 son grupos atractores de electrones; R1 y R2 pueden ser independientemente un grupo aromático o heteroaromático sustituido o no sustituido; y R3 y R4 pueden ser independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo alquilo, arilo, heteroarilo, amino, alcoxilo o ariloxilo sustituido o no sustituido;
20 d) un segundo conductor (3) que se extiende a lo largo de dicha superficie, que comprende un elemento conductor para la conexión con dicho circuito de lectura; e) un electrodo de referencia/auxiliar (6) en contacto con dicho segundo conductor; f) un tercer conductor (2) que se extiende a lo largo de dicha superficie, que 25 comprende un elemento conductor para la conexión con dicho circuito de lectura y un electrodo indicador de relleno (7) en contacto con dicho tercer conductor;
g) estando dichos conductores espaciados de modo que no están en contacto eléctrico, y estando configurados de modo que no se ponen en contacto eléctrico cuando dicha muestra acuosa se pone sobre dicha tira;
30 h) estando configurados dicho electrodo activo y dicho electrodo de
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referencia/auxiliar de modo que pueden cubrirse simultáneamente por una pequeña gota de dicha muestra acuosa para proporcionar un camino de conducción eléctrica entre dichos electrodos.
2. Una tira de electrodos según la reivindicación 1, en la que dicho electrodo activo además comprende una enzima dependiente del cofactor nicotinamida, y un cofactor nicotinamida.
3. Una tira de electrodos según la reivindicación 1, en la que el compuesto mediador es la 1,10-fenantrolinquinona.
4. Una tira de electrodos según la reivindicación 2, en la que la enzima dependiente de cofactor es la glucosa deshidrogenasa.
5. Una tira de electrodos según la reivindicación 2, en la que la enzima dependiente de cofactor es la 3-hidroxibutirato deshidrogenasa.
6. Una tira de electrodos según la reivindicación 1, que además incluye uno o más bucles de circuitos impresos sobre la tira de ensayo, proporcionando cada bucle una resistencia característica del tipo de tira para identificar las tiras de ensayo para medir diferentes analitos.
7. Una tira de electrodos según la reivindicación 1, que además incluye muescas u otras formas cortadas en el extremo proximal de la tira de ensayo para identificar las tiras de ensayo para medir diferentes analitos.
8. Un procedimiento de medición de la concentración en una muestra acuosa de un analito sometido a oxidación por una enzima dependiente de NAD(P)+ que comprende
a) oxidar el analito con la enzima dependiente de NAD(P)+ en presencia de NAD(P)+, en el que el NAD(P)+ está presente en un electrodo de trabajo de una tira de electrodos y en el que la tira de electrodos además comprende un electrodo de referencia/auxiliar y un electrodo indicador de relleno; oxidar el NAD(P)H generado por reacción con el analito y la enzima dependiente de NAD(P)+ con un compuesto mediador que tiene una de las siguientes dos fórmulas:
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**(Ver fórmula)**
en las que X e Y pueden ser independientemente oxígeno, azufre, CR3R4, NR3 o NR3R4+ o el grupo funcional CZ1Z2, en el que Z1 y Z2 son grupos atractores de electrones; R1 y R2 pueden ser independientemente un grupo aromático o heteroaromático sustituido o no sustituido; y R3 y R4 pueden ser independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo alquilo, arilo, heteroarilo, amino, alcoxilo o ariloxilo sustituido o no sustituido;
b) aplicar un potencial eléctrico en el electrodo de trabajo para reoxidar el compuesto mediador reducido al oxidar el NAD(P)H y observar la corriente resultante,
en el que parte del compuesto mediador es reducido por reacción con el NAD(P)H mientras que parte del compuesto mediador es oxidado por la transferencia de electrones a dicho electrodo de trabajo durante un periodo de medición y la tasa de oxidación del compuesto mediador a lo largo de dicho periodo de medición y por consiguiente la corriente resultante observada está relacionada de forma monotónica con la concentración de analito en la muestra.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que la enzima dependiente de NAD(P)+, el NAD(P) y el compuesto mediador se han aplicado en la superficie de dicho electrodo en combinación con un aglutinante y una carga, incluyendo dicho ingrediente aglutinante materiales que aumentan fácilmente la viscosidad del medio acuoso y promueven la formación de películas o capas, y siendo dicho ingrediente de carga un material en partículas que es químicamente inerte a las reacciones de oxidación y reducción implicadas en la medición e insoluble en el medio acuoso.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que la corriente observada durante el periodo de medición está relacionada de forma lineal con la concentración de analito en la muestra.
11. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que el compuesto mediador es la 1,10-fenantrolinquinona.
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12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que la enzima dependiente de cofactor es la glucosa deshidrogenasa.
5 13. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que la enzima dependiente de cofactor es la 3-hidroxibutirato deshidrogenasa.
14. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que el potencial aplicado es 200 mV o menos.
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