SISTEMA DE ENSAYO DE ANALITOS PARA DETERMINAR LA CONCENTRACION DE UN ANALITO EN UN FLUIDO FISIOLOGICO O ACUOSO.

Elemento de prueba de analitos para determinar la concentración de al menos un analito en un fluido de muestra acuoso o fisiológico que tiene una primera superficie (2a) y una segunda superficie (4a) opuestas entre sí a una distancia predeterminada,

ambas superficies provistas de dos patrones sustancialmente equivalentes que forman áreas de alta y baja energía superficial, que están alineadas en su mayor parte de forma congruente, con lo cual las áreas de alta energía superficial (6, 6'') crean un sistema de distribución de muestras con al menos dos áreas de detección (6a, 6''a), caracterizado porque las áreas de detección (6a) de la primera superficie (2a) están provistas de electrodos de trabajo (8a) y las áreas de detección (6''a) de la segunda superficie (4a) están provistas de electrodos de referencia (8''a) correspondientes de los medios de detección electroquímicos

Sistema de ensayo de analitos para determinar la concentración de un analito en un fluido fisiológico o acuoso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo del análisis cuantitativo de un analito, por ejemplo glucosa, en un líquido fisiológico, por ejemplo sangre. Más en particular, esta invención proporciona un sistema de ensayo de analitos y un método de ensayo para la determinación cuantitativa de analitos en un fluido fisiológico o acuoso y un método de preparación.

Antecedentes de la invención

La determinación de concentraciones de analitos en muestras fisiológicas tiene un papel muy importante en el diagnóstico y la terapia de una gran variedad de enfermedades. Entre los analitos de interés se incluyen, entre otros, glucosa, colesterol, ácidos grasos libres, triglicéridos, proteínas, cetonas, fenilalanina, enzimas, anticuerpos o péptidos sanguíneos, plasma, orina o saliva.

Medir la concentración de glucosa en muestras de sangre completa es una tarea particularmente habitual. Debido a que la diabetes provoca complicaciones fisiológicas peligrosas que conducen a la pérdida de la visión, a disfunciones renales y otras consecuencias médicas serias, solamente una terapia muy rigurosa y un control de la enfermedad reducen al mínimo el riesgo de estas consecuencias, con ajustes en ejercicio, dieta y medicación. Con frecuencia, algunos pacientes tienen que comprobar su concentración de glucosa en sangre con tres o más mediciones al día. Estos pacientes, así como los médicos y hospitales, requieren un método preciso, fiable e idealmente poco costoso para ajustar sus regímenes de tratamiento de forma que se eviten las complicaciones a largo plazo de la diabetes mellitus.

La mayor conciencia sobre la enfermedad de la diabetes, la aceptación del autocontrol y el autotratamiento dependen de la disponibilidad de dispositivos adecuados y permiten el desarrollo de múltiples dispositivos y métodos de uso personal y también de pruebas para el cuidado de la salud. Se dispone de pruebas de embarazo, de ovulación, de coagulación sanguínea, cetona y colesterol, como ejemplo de una selección no exhaustiva; pero la más destacada en el área del autocontrol sigue siendo la detección de la glucosa sanguínea en vasos capilares.

Típicamente, se aplica un fluido de muestra fisiológico, por ejemplo sangre capilar, a una tira de ensayo para evaluar la concentración de un analito. En general, las tiras de prueba se utilizan junto con un dispositivo de medida, que mide una ligera reflectancia y/o transmitancia si la tira está diseñada para la detección fotométrica, o ciertas propiedades eléctricas, tales como la corriente eléctrica, si la tira está diseñada para la detección de un compuesto electro-activo.

La Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº EP 0 215 419 A2, por ejemplo, describe un dispositivo y un método para la distribución uniforme de un volumen definido de un espécimen de prueba líquido sobre una superficie reactiva a través de un espacio capilar, para proporcionar un modelo de flujo controlado y predeterminado para el líquido del espécimen. La Patente de Estados Unidos Nº 4.687.529, por otra parte, controla el líquido presente en un material de matriz del reactivo por medio de almohadillas barrera hidrofóbicas en un dispositivo de prueba del reactivo, que impide o minimiza la contaminación cruzada de los reactivos en el sustrato del dispositivo de prueba.

En el último par de años, los biosensores electroquímicos se han destacado en el mercado del diagnóstico y ofrecen al paciente varias ventajas sobre los sistemas de fotometría de reflectancia. Las principales diferencias son las características del llenado capilar de las tiras de prueba, que permiten una más fácil aplicación de la muestra en comparación con los sistemas de fotometría de reflectancia basados en membranas de relleno superior. Adicionalmente, la celda de medida se puede localizar en la punta de la tira, por tanto, la muestra de sangre no estará en contacto directo con el dispositivo de medida (medidor) durante el procedimiento de prueba, lo que mantiene el dispositivo limpio e higiénico, evitando la contaminación de la sangre con el medidor.

Hasta ahora, ha evolucionado una amplia variedad de tiras biosensoras electroquímicas. Un biosensor electroquímico ejemplar, tal como se describe en la patente de Estados Unidos 5,288,636, incluye un electrodo de trabajo y uno de referencia/contador. En la superficie del electrodo de trabajo se dispone un reactivo que incluye una enzima con la capacidad de catalizar una reacción que involucra un sustrato para la enzima, un medidor redox con capacidad de transferir los electrones transferidos entre la enzima y el electrodo de trabajo y un tampón. Cuando se agrega al reactivo un fluido de muestra que contiene el analito a medir, tiene lugar una reacción que oxida el analito y reduce el mediador redox. Después o durante esta reacción, se aplica una diferencia de potencial eléctrico entre los electrodos. Se mide la corriente producida por la electrooxidación de la forma reducida del mediador y se correlaciona con la cantidad de analito en la muestra.

En una realización típica, el sistema electroquímico se compone de dos electrodos en un elemento soporte encerrado por paredes de soporte formando una cavidad que es lo suficientemente pequeña como para ser rellenada por la acción capilar (US 4.900.424; Birth y col., 1987) o con la ayuda de capas de banda o de aspersión (US 5.628.890; Carter y col., 1997).

Debido a las variaciones en la materia prima y procesos, en la fabricación a gran escala de las tiras de analito no se garantiza una adecuada reproducibilidad tira-a-tira de un lote al siguiente. Por tanto, todos los sistemas conocidos requieren tiras de prueba que tienen que ser calibrados durante el proceso de producción. Esta información de calibración se provee en el momento de utilizar el medidor por medios manuales o automáticos. En el primer caso, el usuario tiene que introducir la información de calibración en forma de un número adjunto con cada lote de tiras de prueba, en el segundo caso la información se codifica en la tira ya sea con una barra, un color o una característica de codificación digital. Por tanto, este tipo de información de calibración representa la característica funcional de la tira de prueba en el momento de la producción, que puede ser diferente o no en cuanto a las características de la tira de prueba en el momento de la utilización, la cual puede tener lugar incluso dos años más tarde.

Además, el procedimiento de medición podría verse impedido por otros factores variables en el fluido de muestra fisiológico. Una complicación típica en los análisis de sangre completa es la variabilidad de los niveles de eritrocitos, que conduce a resultados que pueden no reflejar la concentración real de los analitos de la muestra.

La PCT/EP 2004002284 describe una tira de prueba reactiva seca para la detección fotométrica y la determinación cuantitativa de un analito en un fluido fisiológico que está provisto de un sistema de calibración integrado utilizando el método de adición estándar.

Sin embargo, hasta ahora, no existe ningún sistema de prueba de analitos que sea adecuado para la detección electroquímica y la determinación cuantitativa de un analito en un fluido fisiológico y que esté provisto de un medio de calibración y de control de calidad integrados.

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un sistema de prueba de analitos con un medio de calibración integrado que justifique y compense cualquier variabilidad que pueda ser generada por fluctuaciones en el proceso de producción o por la variabilidad de la muestra analizada misma, que posea medios de detección electroquímicos para medir la concentración de un analito en una muestra de fluido fisiológico.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un proceso de producción para el elemento de prueba de analito electroquímico que no implique pasos de producción numerosos y complicados y que, por tanto, no sea costoso y sea aplicable a productos que ayuden a los pacientes en el autocontrol de la glucosa en sangre o de otros parámetros fisiológicos importantes.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un elemento para determinar la concentración de un analito, tal como glucosa, colesterol, ácidos grasos libres, triglicéridos, proteínas, cetonas, fenilalanina o enzimas, en un fluido fisiológico tal como sangre, suero, plasma, saliva,...

1. Elemento de prueba de analitos para determinar la concentración de al menos un analito en un fluido de muestra acuoso o fisiológico que tiene una primera superficie (2a) y una segunda superficie (4a) opuestas entre sí a una distancia predeterminada, ambas superficies provistas de dos patrones sustancialmente equivalentes que forman áreas de alta y baja energía superficial, que están alineadas en su mayor parte de forma congruente, con lo cual las áreas de alta energía superficial (6, 6') crean un sistema de distribución de muestras con al menos dos áreas de detección (6a, 6'a), caracterizado porque las áreas de detección (6a) de la primera superficie (2a) están provistas de electrodos de trabajo (8a) y las áreas de detección (6'a) de la segunda superficie (4a) están provistas de electrodos de referencia (8'a) correspondientes de los medios de detección electroquímicos.

2. Elemento de prueba de analitos según la reivindicación 1, caracterizado porque la distancia entre la primera y la segunda superficies es determinada por una capa central (3) que se dispone entre una capa base (2) y una capa de recubrimiento (4) que contiene las superficies primera y segunda (2a, 4a).

3. Elemento de prueba de analitos según la reivindicación 2, caracterizado porque la capa central (3) tiene una discontinuidad (5) para formar una cavidad hueca con las superficies primera y segunda (2a, 4a) de la capa base y de recubrimiento (2, 4), siendo dicha cavidad hueca más grande que el sistema de distribución de muestras formado por las áreas de alta energía superficial (6, 6') en la primera y la segunda superficies (2a, 4a).

4. Elemento de prueba de analitos según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dichas áreas de alta energía superficial (6, 6') son creadas por una composición hidrofílica insoluble en agua aplicada sobre las superficies primera y segunda (2a, 4a).

5. Elemento de prueba de analitos según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dichas áreas de alta energía superficial (6, 6') en la primera y la segunda superficies (2a, 4a) están limitadas por capas de aislamiento hidrofóbicas (14, 14') que proporcionan áreas de baja energía superficial.

6. Elemento de prueba de analitos según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque

n áreas de detección predeterminadas (6a) que recubren los electrodos de trabajo (8a) de dicha primera superficie (2a) están recubiertas con una formulación catalítica que favorece la detección electroquímica de un analito en un fluido fisiológico y

n áreas de detección predeterminadas (6'a) que recubren los electrodos de referencia (8'a) de dicha segunda superficie (4a) están recubiertas con n formulaciones de calibración compuestas de m formulaciones preformadas y n-m formulaciones con distintos niveles de compuesto de calibración, siendo n un número entero superior a 2, m un número entero igual o superior a 1, y n > m.

7. Elemento de prueba de analitos según la reivindicación 6, caracterizado porque se proporciona adicionalmente un área de detección (6c) que no contiene ningún compuesto catalítico ni tampoco el compuesto de calibración y que permite la medición de señales de fondo.

8. Elemento de prueba de analitos según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho compuesto de calibración contenido en la formulación de calibración recubierto en n-m áreas de detección predeterminadas (6'a) de la segunda superficie (4a) es idéntico o sustancialmente equivalente al analito y tiene la capacidad de inducir la misma reacción química en la formulación catalítica que el analito de la muestra de fluido fisiológico.

9. Elemento de prueba de analitos según la reivindicación 8, caracterizado porque el compuesto de calibración es glucosa.

10. Elemento de prueba de analitos según la reivindicación 6, caracterizado porque la formulación catalítica contiene como componentes reactivos un promotor que experimenta una reacción catalítica o no catalítica con el analito y/o una coenzima, y un mediador que genera una señal electroquímica en la superficie de un electrodo.

11. Elemento de prueba de analitos según la reivindicación 10, caracterizado porque el promotor es una enzima seleccionada de entre el grupo consistente en deshidrogenasas, quinasas, oxidasas, fosfatasas, reductasas y/o transferasas.

12. Elemento de prueba de analitos según la reivindicación 11, caracterizado porque el promotor es una enzima específica para la glucosa.

13. Elemento de prueba de analitos según la reivindicación 10, caracterizado porque el mediador para determinar la concentración de analitos se selecciona de entre el grupo consistente en hexacianoferrato (III) de potasio, tetraciano-p-quinona-dimetano (TCNQ), metilviologen (MV2+), tetratiafulvaleno (TTF), N-metilfenzinio (NMP+), rutenio (III) hexamina, bipiridina de osmio, ferroceno o sus derivados.

14. Elemento de prueba de analitos según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se proporciona en forma de tira donde un área de aplicación de muestras (9) se localiza en el extremo de una extensión lateral y convexa (10) en un lado de dicha tira de prueba de analitos.

15. Disposición de una prueba de analitos que incluye una pluralidad de elementos de prueba de analitos según una de las reivindicaciones anteriores que están dispuestos simétricamente alrededor de un punto central para formar un disco de prueba de analitos (29) con áreas de aplicación de muestras orientadas hacia fuera (9).

16. Disposición de una prueba de analitos que incluye una pluralidad de elementos según al menos una de las reivindicaciones anteriores que están dispuestos de manera lineal para formar una banda de prueba de analitos (43) con extensiones laterales que forman las áreas de aplicación de muestras (9).

17. Método para preparar un elemento de prueba de analitos que comprende los pasos de:

aplicar un patrón de electrodos de trabajo (8) en una primera capa (2) que tiene una primera superficie (2a),

aplicar un patrón correspondiente de electrodos de referencia (8') en una segunda capa (4) que tiene una segunda superficie (4a),

generar áreas de alta y baja energía superficial en la primera superficie (2a),

generar un patrón correspondiente de áreas de alta y baja energía superficial en la segunda superficie (4a), formando las áreas de alta energía superficial (6, 6') un sistema hidrofílico de distribución de muestras con n áreas de detección predeterminadas (6a, 6'a), donde n es un número entero superior a 2 y donde los electrodos de trabajo y de referencia (8, 8') se localizan por debajo de las n áreas de detección predeterminadas (6, 6') del sistema hidrofílico de distribución de muestras,

recubrir con una formulación catalítica las n áreas de detección (6a) de la primera superficie, favoreciendo dicha formulación catalítica la detección de una concentración de analitos contenida en una muestra de fluido fisiológico utilizando medios de detección electroquímica,

recubrir con las n formulaciones de calibración las n áreas de detección (6'a) de la segunda superficie, estando compuestas dichas n formulaciones de calibración de m formulaciones preformadas y de n-m formulaciones con distintos niveles de compuesto de calibración, donde m es un número entero de al menos 1 y n > m, idénticas o sustancialmente equivalentes al analito y con capacidad de inducir la misma reacción química en la formulación catalítica que el analito en la muestra de fluido fisiológico,

aplicar las capas de la primera y la segunda superficies a los sitios opuestos de una capa central (3) que tiene una discontinuidad (5) que proporciona una cavidad para el sistema de distribución de muestras formada por las áreas de alta energía superficial (6, 6') en la primera y la segunda superficies (2a, 4a) de la primera y la segunda capas (2, 4).

18. Método para preparar un elemento de prueba de analitos según la reivindicación 17, caracterizado porque dichas áreas de alta energía superficial (6, 6') se crean mediante la aplicación de una composición hidrofílica insoluble en agua en la primera y la segunda superficies (2a, 4a).

19. Método para preparar un elemento de prueba de analitos según una de las reivindicaciones 17 y 18, caracterizado porque dichas áreas de baja energía superficial se crean mediante la aplicación de composiciones hidrofóbicas en la primera y la segunda superficies (2a, 4a), formando capas eléctricamente aislantes (14, 14') que rodean las áreas de alta energía superficial (6, 6').

20. Método para preparar un elemento de prueba de analitos según una de las reivindicaciones 18 y 19, caracterizado porque dichas composiciones hidrofílicas y/o hidrofóbicas se imprimen en la primera y la segunda superficie por medio de flexografía, litografía, grabado, método de recubrimiento de tinta sólida o impresión por chorro de tinta.

21. Método para preparar un elemento de prueba de analitos según una de las reivindicaciones 17 a 20, caracterizado porque dichas composiciones catalíticas y/o de calibración recubren las áreas de detección (6a, 6'a) de la primera y la segunda superficies por medio de impresión por chorro de tinta o micro-dispensación.

22. Método para preparar un elemento de prueba de analitos según una de las reivindicaciones 17 a 21, caracterizado porque la capa base (2) y la capa de recubrimiento (4) se forman a partir de un sustrato flexible y plegado a lo largo de una línea de plegado centrado longitudinal (45) para encerrar la capa central (3) de manera que los patrones hidrofílicos (6, 6') que forman el sistema de distribución de muestras con las áreas de detección predeterminadas (6'a, 6a) y los correspondientes electrodos de trabajo y de referencia (8, 8') de dichas primera superficie (2a) y segunda superficie (4a) están alineados y registrados para que en su mayor parte sean congruentes.

23. Sistema de prueba de analitos para determinar la concentración de un analito en un fluido de muestra acuoso o fisiológico que comprende:

un elemento de prueba de analitos o disposición de prueba de analitos según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque n áreas de detección predeterminadas (6a) de una primera superficie (2a) están recubiertas con una formulación catalítica que favorece la detección de un analito en un fluido fisiológico, y

n áreas de detección predeterminadas (6'a) de una segunda superficie (4a) están recubiertas con n formulaciones de calibración compuestas de m formulaciones preformadas y n-m formulaciones con distintos niveles del compuesto de calibración, donde n es un número entero superior a 2, m es un número entero igual o superior a 1 y n > m,

medios de detección electroquímica para detectar una señal electroquímica de la muestra fisiológica localizada en 2n áreas de detección predeterminadas y obtener n resultados de 2n áreas de detección predeterminadas, y

medios de procesamiento para calcular todos los coeficientes de calibración de una ecuación de calibración polinomial de los que se dispone a partir de las n mediciones que obedecen a:

y un coeficiente de regresión para validar la calidad de los coeficientes de calibración calculados de la ecuación de calibración.

24. Método para determinar la concentración de al menos un analito en una muestra acuosa o fisiológica, comprendiendo dicho método:

la conexión de un elemento de prueba de analitos a un medio de detección y procesamiento,

la aplicación de una muestra fisiológica a un elemento de prueba de analitos que tiene una primera superficie (2a) y una segunda superficie (4a) opuestas entre sí a una distancia predeterminada, estando provistas dichas ambas superficies de dos patrones sustancialmente equivalentes (6, 6') que forman áreas de alta energía superficial que están alineadas en su mayor parte de forma congruente para crear un sistema de distribución de muestras con al menos dos áreas de detección (6a) cubriendo cada una de ellas un electrodo de trabajo (8) y al menos dos áreas de detección (6'a), cubriendo cada una de ellas un electrodo de referencia (8'a),

la detección de las señales producidas en las distintas áreas de detección, y

la relación de las señales para determinar la cantidad de analito(s) en la muestra fisiológica.

25. Elemento de prueba de analitos para determinar la concentración de al menos un analito en un fluido de muestra fisiológico o acuoso que tiene una primera superficie y una segunda superficie opuestas entre sí a una distancia predeterminada, caracterizado porque una de entre las superficies primera y segunda está provista de un patrón hidrofílico/hidrofóbico y porque la superficie correspondiente proporciona un patrón homogéneo de píxeles hidrofílicos rodeados por un área hidrofóbica creando así una superficie con carácter semihidrofílico y semihidrofóbico, por medio de lo cual las áreas hidrofílicas y semihidrofílicas crean un sistema de distribución de muestras con al menos dos áreas de detección, estando provistas dichas áreas de detección de la primera superficie de electrodos de trabajo y estando provistas las áreas de detección de la segunda superficie de los correspondientes electrodos de referencia (8'a) de los medios de detección electroquímica.