Un procedimiento para producir una célula de replicación del replicón,

que comprende introducir un ARN replicón en una célula, en el que la célula es una célula cualquiera seleccionada del grupo constituido por una célula HepG2, una célula IMY-N9, una célula Hela y una célula 293, en el que el ARN replicón comprende el ARN siguiente (a) o (b):

(a)un ARN que comprende la secuencia nucleotídica como se muestra en las SEC ID Nº 1 ó 2; y

(b)un ARN que comprende una secuencia nucleotídica derivada de la secuencia nucleotídica como se muestra en las SEC ID Nº 1 ó 2 mediante deleción, sustitución o adición de 1 a 10 nucleótidos y que es capaz de una replicación autónoma

Constructo de ácido nucleico que contiene el virus de la hepatitis C (VHC) del ácido nucleico de origen genómico de genotipo 2a y célula que tiene el constructo de ácido nucleico transferido a su interior.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un ARN replicón del virus de la hepatitis C del genotipo 2a, una célula de replicación en replicón en la que se introduce el ARN replicón y a un procedimiento de incrementar la eficiencia de la replicación del ARN replicón.

Técnica anterior

El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus que pertenece a la familia Flaviviridae. Posee un ARN monocatenario sentido de hebra (+) como genoma y se sabe que produce hepatitis C. En estudios recientes se ha revelado que el virus de la hepatitis C se clasifica en una serie de tipos basándose en genotipos o serotipos. De acuerdo con el análisis filogenético de Simmonds y col. usando las secuencias nucleotídicas de las cepas del VHC, que actualmente es un procedimiento fundamental para clasificar los genotipos del VHC, el VHC se clasifica en 6 genotipos: genotipo 1a, genotipo 1b, genotipo 2a, genotipo 2b, genotipo 3a y genotipo 3b (véase Simmonds, P. y col., Hepatology, (1994) 10, pág. 1321-1324). Cada uno de estos tipos se clasifica además en varios subtipos. Hasta la fecha se han determinado las secuencias nucleotídicas de los genomas de longitud completa de una serie de genotipos del VHC (véase la publicación de patente japonesa (denominada Kokai) nº 2002-171978 A; Choo y col., Science, (1989) 244, pág. 359-362; Kato y col., J. Med. Virol., (2001) 64(3) pág. 334-339; Okamoto, H y col., J. Gen. Virol., (1992) 73 pág. 673-679; y Mori, S. y col., Biochem. Biophis. Res. Commun., (1992) 183, pág. 334-342).

El VHC produce la hepatitis crónica mediante infección persistente. Actualmente, la principal causa de la hepatitis crónica observada en todo el mundo es la infección persistente por VHC. En realidad, alrededor del 50% de los individuos con infección persistente desarrolla hepatitis crónica. La hepatitis crónica en alrededor del 20% de estos pacientes pasa a cirrosis hepática durante el curso de 10 a 20 años y, en algunos de estos pacientes progresa a afecciones patológicas mortales avanzadas, tales como cáncer hepático.

Actualmente, la hepatitis C se trata principalmente mediante tratamiento con interferón-a o interferón-ß o usando una combinación de interferón-a y ribavirina, el derivado de nucleósidos de purina. No obstante, incluso cuando se llevan a cabo estas terapias, los efectos terapéuticos sólo se observan en aproximadamente el 60% de todos los pacientes tratados. Cuando las terapias terminan después de ejercer los efectos, la enfermedad se recrudece en más de la mitad de los pacientes. Se sabe que el efecto terapéutico de los interferones está relacionado con los genotipos del VHC y se dice que es menor contra el genotipo 1b y mayor contra el genotipo 2a (véase Yoshioka y col., Hepatology, (1992) 16(2): pág. 293-299).

Es un objetivo importante desarrollar agentes terapéuticos o agentes profilácticos eficaces contra la hepatitis C, cuya tasa de incidencia es mayor en los países industrializados, para la que actualmente no hay un tratamiento de la causa y que, por último, produce resultados graves. Por tanto, es muy necesario el desarrollo de quimioterapias específicas del VHC y terapias vacunales. Una diana para el desarrollo de un agente anti-VHC puede ser la supresión de la replicación del VHC o la supresión de la infección de las células con el VHC.

Hasta recientemente ha sido difícil la propagación del VHC en un sistema de cultivo celular e infectar células cultivadas con el VHC- Además, un chimpancé ha sido el único animal que ha podido ser infectado con VHC y puede usarse en experimentos, de modo que ha sido difícil llevar a cabo estudios sobre el mecanismo de replicación del VHC y el mecanismo de infección del VHC. No obstante, recientemente se han preparado replicones de ARN subgenómico del VCH como ARN derivado del VHC replicable de forma autónoma (véase la publicación de patente japonesa (de tipo kokai) nº 2001-17187 A; la solicitud de patente europea EP 1 043 399; Lohmann y col., Science, (1999) 285, pág. 110-113; Blight y col., Science, (2000) 290, pág. 1972-1974; Friebe y col., J. Virol., (2001) 75 (24): pág. 12047-12057; Ikeda y col., J. Virol., (2002) 76(6): pág. 2997-3006), que permite el análisis del mecanismo de replicación del VHC usando células cultivadas. Estos replicones de ARN subgenómico del VCH se preparan, cada uno, sustituyendo proteínas estructurales que existen en dirección 3' de IRES del VHC en la región 5' sin traducir del ARN genómico del VHC de genotipo 1b con un gen de resistencia a neomicina e IRES de EMCV que se ha ligado en una zona posterior al gen de resistencia. En la solicitud de patente europea EP 1 043 399 se ha demostrado que este replicón del ARN se replica de forma autónoma en células de cáncer hepático humano, células Huh7, cuando se introducen en las células Huh7 seguido de cultivo en presencia de neomicina. No obstante, Ikeda y col. indicaron que la replicación in vitro de un replicón subgenómico derivado de cepas del VHC distintas a la del genotipo 1b no había tenido éxito.

Sin embargo, respecto a dichos sistemas de replicación de ARN intracelular para HeV, hasta ahora sólo se han preparado los que usaron ARN genómico del genotipo 1b Dado que ha habido un informe de que diferentes genotipos de VHC también difieren en las proteínas virales codificadas, puede ser difícil aclarar suficientemente el mecanismo de replicación del VHC analizando únicamente los replicones de ARN subgenómico derivados del VHC del genotipo 1b. Además, sobre la base del hecho de que los efectos terapéuticos de los interferones difieren en función de los genotipos de VHC, puede ser particularmente difícil desarrollar un agente anti-VHC que tenga un efecto sobre varios tipos de VHC mediante el uso de únicamente un sistema de replicación de VHC que contiene el replicón de ARN subgenómico del VHC de genotipo 1b.

Sumario de la invención

El contenido de las solicitudes de patente japonesa nº 2003-148242 y 2003-329115, de los que la presente solicitud reivindica prioridad, se incorporan en la presente memoria descriptiva.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un ARN replicón derivado de VHC de un genotipo de VHC para el que el ARN replicón todavía no se ha preparado.

Como resultado de exhaustivos estudios para alcanzar el objeto anterior, los autores han tenido éxito en la preparación del ARN replicón del VHC de genotipo 2ª.

Es decir, la presente invención es del siguiente modo.

1. Un procedimiento para producir una célula de replicación del replicón, que comprende introducir un ARN replicón en una célula, en el que la célula es una célula cualquiera seleccionada del grupo constituido por una célula HepG2, una célula IMY-N9, una célula Hela y una célula 293, en el que el ARN replicón comprende el ARN siguiente (a) o (b):

2. Una célula de replicación en replicón, que se prepara mediante el procedimiento de la reivindicación 1.

3. Uso de la célula de replicación de replicón de la reivindicación 2 para producir o evaluar un agente terapéutico o un agente diagnóstico contra la infección por el virus de la hepatitis C.

4. Uso de la célula de replicación del replicón de la reivindicación 2 para producir una vacuna contra la infección por el virus de la hepatitis C.

5. Un procedimiento de producir un ARN replicón del virus de la hepatitis C del genotipo 2a, que comprende extraer el ARN replicón de la célula de replicación del replicón de la reivindicación 2.

6. Un procedimiento de producir una proteína viral del virus de la hepatitis C del genotipo 2a, que comprende cultivar la célula de replicación del replicón de la reivindicación 2 y obtener la proteína viral del producto de cultivo resultante.

7. Un procedimiento de detección selectiva de una sustancia que estimula o suprime la replicación del virus de la hepatitis C, que comprende cultivar la célula de replicación del replicón de la reivindicación 2 en presencia de una sustancia de prueba y detectar la replicación de un ARN replicón en el producto de cultivo resultante.

8. Un procedimiento de incrementar la eficiencia de la replicación del ARN replicón del virus de la hepatitis C de genotipo 2a, que comprende realizar una vez o más del siguiente: obtener de la célula de replicación del replicón de la reivindicación 2 un ARN replicón replicado e introducir el ARN replicón replicado obtenido de este modo en una célula que es diferente de la célula de replicación del replicón para preparar una nueva célula de replicación del replicón.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la eficiencia de replicación aumenta hasta ser al menos dos veces mayor que la del ARN replicón que se introduce al principio en la célula de replicación del replicón.

10. Un procedimiento de producir un ARN replicón del virus de la hepatitis C de genotipo 2a, que tiene una mayor eficiencia de replicación, que comprende realizar una vez o más del siguiente: obtener de la célula de replicación del replicón de la reivindicación 2 (un ARN replicón replicado) e introducir el ARN replicón replicado obtenido de este modo en una célula que es diferente de la célula de replicación del replicón para preparar una nueva célula de replicación del replicón.; y obtener un ARN replicón replicado de la célula de replicación del replicón obtenida finalmente.

11. Un procedimiento de producir un ARN replicón del virus de la hepatitis C del genotipo 2a que tiene una mayor eficiencia de replicación, que comprende detectar una mutación nucleotídica o una mutación aminoacídica entre el ARN replicón que se produce de modo que tenga una mayor eficiencia de replicación mediante el procedimiento de la reivindicación 10 y el ARN replicón que se introduce al principio en la célula de replicación del replicón; e introducir la mutación nucleotídica o la mutación aminoacídica detectada de este modo en un ARN replicón cuya eficiencia de replicación se va a incrementar.

12. Un ARN replicón que comprende una secuencia nucleotídica derivada de la secuencia nucleotídica como se muestra en la SEC ID Nº 1 en al menos una mutación seleccionada del grupo constituido por las siguientes (a) a (m):

13. Una célula de replicación del replicón, que se prepara mediante la introducción del ARN replicón de la reivindicación 12 en la célula eucariótica.

14. La célula de replicación del replicón de la reivindicación 13, en la que la célula eucariótica es una célula cualquiera seleccionada del grupo constituido por una célula Huh7, una célula HepG2, una célula IMY-N9, una célula HeLa y una célula 293.